《Protein Science》：Phosphorylation disrupts the interaction between the intrinsically disordered region of the oncogenic NDRG1 and lipid vesicles
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本期推荐一篇关于癌蛋白NDRG1分子机制的前沿研究。文章聚焦NDRG1的C端本质无序区（IDR），运用多种生物物理技术（如CD、NMR、EPR、FTIR、ITC）揭示磷酸化如何作为一种“分子开关”，通过改变蛋白构象与静电特性，调控其与镍离子（Ni(II)）及负电荷脂质囊泡的相互作用，从而影响其亚细胞定位与致癌功能，为镍与污染驱动的肺癌治疗提供了新思路。
1 引言
N-myc下游调控基因1（NDRG1）是一种广泛表达的多功能蛋白，参与细胞生长、分化、增殖、脂质回收和应激反应等关键过程。其在癌症生物学中的作用呈现出多效性且依赖于环境，在不同肿瘤类型中扮演不同角色。在一些癌症中，它作为转移抑制因子，而在另一些癌症（如肺癌）中，它则充当癌基因。在非小细胞肺癌（NSCLC）中，NDRG1过表达与化疗耐药性相关，并与其在镍暴露（空气污染中的一种已知肿瘤驱动因子）反应中的作用密切相关。镍被国际癌症研究机构（IARC）列为I类致癌物，其暴露通过激活缺氧反应导致NDRG1上调。值得注意的是，NDRG1能直接结合Ni(II)离子，连接镍诱导的上调及其作为金属结合蛋白的功能。
Ni(II)特异性地结合在NDRG1的C末端序列（称为NDRG1C），这是一个由84个残基组成的本质无序区（IDR），在其他NDRG同源物中不存在。该区域包含一个3×10残基的重复序列，其中有三个Ni(II)结合组氨酸（His）残基。该区域还介导与膜的关联，并参与与癌症相关的关键过程，如侵袭、粘附、增殖和分化。此外，NDRG1C包含多个丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）磷酸化位点，影响着其亚细胞定位、蛋白间相互作用以及包括凋亡和肿瘤抑制在内的功能结果。
本研究旨在从分子层面详细表征NDRG1*C与膜囊泡的相互作用，并探讨磷酸化如何影响其作为Ni(II)和脂质结合模块的作用。
2 结果
2.1 NDRG1C被PKA磷酸化*
为研究NDRG1C磷酸化的分子效应，研究团队将表达His-ZZ标签NDRG1C的载体与携带蛋白激酶A（PKA）催化亚基基因的质粒共转化到大肠杆菌中，成功获得了磷酸化的NDRG1C蛋白。质谱分析显示，纯化后的蛋白样品含有携带四个（45%）和五个（52%）磷酸基团的NDRG1C分子的混合物。
2.2 磷酸化的NDRG1C保持其本质无序行为*
通过圆二色谱（CD）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析，发现磷酸化使NDRG1*C的α-螺旋含量增加了一倍（从约6%增至13%），同时β-链含量有所下降，但蛋白总体上仍保持高度动态和无序的本质。连续波电子顺磁共振（CW-EPR）光谱结合位点定向自旋标记（SDSL）技术显示，磷酸化并未显著改变所探测位点（S336、S357、S378）的局部动态特性。核磁共振（NMR）化学位移扰动（CSP）分析进一步表明，磷酸化主要发生在N末端区域的M324–D338序列内，该序列包含五个Ser/Thr位点（S326、T328、S330、S332、S333）。有趣的是，该区域与一个具有固有α-螺旋倾向的序列相重叠。
2.3 磷酸化改变了NDRG1C的Ni(II)结合模式*
等温滴定量热法（ITC）研究表明，磷酸化NDRG1*C对Ni(II)的亲和力比未修饰蛋白提高了近三倍（KD= 13 μM）。更重要的是，磷酸化完全重塑了Ni(II)的结合位点。在未修饰蛋白中，Ni(II)主要与3R重复序列内的四个组氨酸残基（H345、H355、H365、H371）配位。而在磷酸化蛋白中，Ni(II)的结合位点转移到了磷酸化的N末端区域，可能是由于带负电的磷酸基团对Ni(II)的静电吸引所致。Ni(II)的结合还逆转了磷酸化诱导的α-螺旋稳定，降低了磷酸化蛋白的螺旋含量。
13C直接检测在pH 7.5条件下获得的CON光谱和CACO光谱的峰强度比。">
2.4 磷酸化消除了NDRG1C与脂质体的相互作用*
共沉降分析表明，未修饰的NDRG1C能与由负电荷脂质（如DMPG或DMPC:DMPG=1:1）组成的囊泡结合并共沉淀，但不能与中性脂质（DMPC）囊泡结合，证实了静电相互作用驱动蛋白-脂质结合。然而，磷酸化完全阻断了NDRG1C与任何脂质囊泡的结合，这可能是由于引入的多个带负电的磷酸基团对带负电的膜产生了静电排斥。光谱分析显示，与DMPG囊泡结合后，未修饰NDRG1*C的α-螺旋含量从6%增加至15%，并且其N末端区域（S336附近）的流动性显著降低，表明该区域发生了诱导折叠。相比之下，磷酸化蛋白在囊泡存在下未表现出显著的结构变化。
Proxyl NDRG1C在未修饰和磷酸化状态下，以及无或有DMPC和DMPG脂质体存在时的CW-EPR谱。(e) NDRG1C在无和有DMPG脂质体存在时，通过13C直接检测在pH 7.5条件下获得的CACO光谱的峰强度比。(f) 通过ITC获得的结合等温线拟合得到的热力学参数（ΔG, 蓝色; ΔH, 绿色; -TΔS, 红色）。">
3 讨论与结论
本研究阐明了NDRG1的C端本质无序区（NDRG1*C）如何作为一个动态的调控模块，整合多位点磷酸化、Ni(II)配位和脂质相互作用，从而决定NDRG1的定位和功能。研究的关键发现包括：
- 1.
磷酸化作为构象调节器：PKA介导的磷酸化主要发生在NDRG1*C的N末端区域（M324-D338），导致该区域局部α-螺旋倾向性增加，但整体上蛋白仍保持无序和高度动态的特性。
- 2.
磷酸化重塑金属结合：磷酸化不仅适度提高了NDRG1*C对致癌金属镍（Ni(II)）的亲和力，更重要的是将Ni(II)的主要结合位点从富含组氨酸的3R重复序列完全转移到了磷酸化的N末端区域。这揭示了磷酸化如何通过改变静电特性，重新布线蛋白的金属结合能力。
- 3.
磷酸化充当膜结合“开关”：未修饰的NDRG1*C通过静电作用与带负电荷的脂质膜（如DMPG）特异性结合，并在此过程中诱导局部（尤其是N末端区域）的结构折叠（α-螺旋增加）。然而，磷酸化引入的负电荷完全阻断了这种结合，表明磷酸化可以作为一种“分子开关”，将NDRG1从膜结合状态转换为可溶性状态。
- 4.
功能整合与病理意义：这些分子机制的整合为理解NDRG1在癌症中的复杂行为提供了框架。在肺癌（尤其是NSCLC）中，镍暴露会上调NDRG1并促进其磷酸化。磷酸化可能通过将NDRG1从膜上解离，影响其在脂质代谢、囊泡运输和信号传导中的功能，同时改变其与Ni(II)的相互作用模式，共同促进肿瘤的侵袭性和耐药性。
总之，这项工作从分子层面深入解析了磷酸化如何调控NDRG1的构象、膜结合及金属相互作用，确立了NDRG1C作为一个关键的调控枢纽和“分子开关”的地位。这些发现不仅增进了对NDRG1致癌机制的理解，更重要的是，为开发针对NDRG1C这一“热点”靶点的干预策略，以治疗镍驱动和脂质代谢重编程的癌症，提供了新的理论基础和潜在途径。
