《The Plant Genome》：Quick creation and mapping of EMS-induced maize kernel mutants identifies classical gene ZmBT1 and novel gene ZmTOP6A
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本研究通过EMS（乙基甲磺酸）花粉诱变技术在五个玉米自交系中快速创制了超过400个独立籽粒突变体，并利用BSA（集群分离分析法）结合全基因组测序成功定位了两个代表性突变体的关键基因：导致籽粒皱缩的经典ADP-葡萄糖转运蛋白基因ZmBT1和引起籽粒变小的新型DNA拓扑异构酶VI A亚基基因ZmTOP6A。研究通过等位验证、蛋白保守性、表达模式及亚细胞定位分析，确认了这两个基因的功能，展现了EMS诱变与BSA联用策略在挖掘玉米籽粒发育基因、解析遗传网络及驱动分子育种方面的巨大潜力与高效性。
1 引言
玉米(Zea mays L.)是全球主要谷类作物，也是研究籽粒（种子）发育的正向与反向遗传学关键模式生物。传统定位克隆方法耗时费力，而基于参考基因组和测序技术进步的集群分离分析（BSA）与高通量测序结合，显著加速了突变基因的鉴定。本研究旨在利用EMS花粉诱变技术创制玉米籽粒突变体，并运用BSA与全基因组测序（WGS）策略快速鉴定相关基因，以深化对籽粒发育分子机制的理解。
2 材料与方法
研究使用了五个花期相近的玉米自交系：B73、MO17、PH6WC、PH4CV和W9816。采用改良的EMS花粉诱变法进行诱变处理，通过自交获得M2代并筛选籽粒性状分离的穗。对每个突变体构建野生型池（WP）和突变型池（MP），提取DNA进行全基因组测序。利用BWA等工具将测序数据比对至玉米参考基因组，通过变异检测和注释，采用改进的“MutMap”方法进行关联定位。计算SNP-index（突变型等位基因频率）和SNP-index.DIV值，筛选候选区域和因果突变。此外，研究还进行了基因保守性分析、表达模式分析以及利用玉米原生质体进行了亚细胞定位实验。
3 结果
3.1 通过EMS花粉诱变快速创制玉米籽粒突变体
五个玉米自交系经EMS诱变后表现出不同的处理效果。B73和MO17受影响最严重，而W9816影响最小。最终获得了总计421个玉米籽粒突变体（M2代），来自不同遗传背景。突变体表现出广泛的表型变异，包括胚、胚乳和其他籽粒结构的各种缺陷。大部分突变体遵循野生型与突变型籽粒3:1的分离比，表明表型由单基因的隐性等位基因控制。
3.2 皱缩籽粒突变体(B73_KM#4)的表型观察与基因定位
B73_KM#4（bt1-1）表现出典型的籽粒皱缩/塌陷表型，胚乳几乎缺失，籽粒重量约为野生型的一半。通过BSA策略结合WGS进行基因定位，测序数据分析揭示了一个错义突变（c.464C > T|p.P155L）位于基因Zm00001eb235570（brittle endosperm 1, ZmBT1）上，该基因编码ADP-葡萄糖转运蛋白，与突变表型相关。
等位验证进一步确认了ZmBT1是导致皱缩表型的关键基因。另外两个皱缩籽粒突变体（bt1-2和bt1-3）也被鉴定出存在ZmBT1基因的无义突变。杂合子间的杂交均表现出相似的野生型与皱缩籽粒分离模式。
3.3 ZmBT1的保守性分析、基因表达模式及亚细胞定位
保守性分析表明，ZmBT1属于“腺嘌呤核苷酸转运蛋白BT1”家族，在禾本科（Poales）物种中形成一个特异性聚类。表达模式分析显示，ZmBT1在发育的胚乳中特异性高表达。亚细胞定位实验发现，ZmBT1及其P155L突变体形式定位于叶绿体（在胚乳细胞中则为淀粉体），而两个截短突变体（W186和Q118）则呈现点状分布模式。
3.4 新型小籽粒突变体(B73_KM#44)的表型观察与基因定位
B73_KM#44是一个新发现的小籽粒（或缺陷型）突变体，其典型的角质胚乳缺失，籽粒重量比野生型低约20%，且不能萌发。BSA基因定位将候选区域锁定在1号染色体起始位置附近，并鉴定出两个候选突变。其中，基因Zm00001eb013040（DNA topoisomerase VI A subunit, ZmTOP6A）的起始密码子丢失突变（c.3G > A|p.M1?）被认为是导致小籽粒表型的最可能原因。
从maizeEMSDB获得的另一个EMS诱导突变体（top6a-2）携带ZmTOP6A的无义突变（c.1231C > T|p.Q411*）。等位测试证实了ZmTOP6A的功能缺失突变是导致籽粒变小、角质胚乳缺失和种子致死表型的原因。
3.5 ZmTOP6A的保守性分析、基因表达模式及亚细胞定位
ZmTOP6A属于“拓扑异构酶”基因家族。保守性分析显示，ZmTOP6A与其在禾本科和拟南芥中的近缘同源物形成一个独立的聚类。表达谱分析表明ZmTOP6A无明显组织特异性，与其致死表型一致。亚细胞定位实验证实ZmTOP6A及其突变形式均定位于细胞核。
4 讨论
4.1 利用EMS花粉诱变快速创制玉米籽粒突变体
本研究证明了利用EMS花粉诱变产生玉米籽粒突变体的高效性。相较于经典自交系（B73, MO17），三个现代商业自交系（PH6WC, PH4CV, W9816）在产生籽粒突变体方面效率更高。在两个生长季内，研究成功获得了约400个独立籽粒突变体，覆盖了广泛的表型变异。
4.2 结合EMS诱变与BSA进行基因定位的优势
EMS诱变在全基因组范围内产生大量随机分布的SNPs，结合BSA和WGS可高效定位突变基因，无需与不同生态型杂交，避免了杂种优势等干扰。这种策略为快速鉴定玉米籽粒发育相关基因提供了有力工具。
4.3 ZmBT1参与玉米储藏淀粉的生物合成
ZmBT1被确认为导致皱缩籽粒表型的因果基因。作为ADP-葡萄糖转运蛋白，ZmBT1在禾本科物种胚乳淀粉合成中起着关键作用。其功能缺失会导致淀粉合成受阻，游离糖积累，最终形成皱缩籽粒表型。ZmBT1在禾本科中特异存在，可能在其进化分化及作为主粮作物的高效淀粉合成能力中扮演了关键角色。
4.4 ZmTOP6A参与玉米籽粒发育
ZmTOP6A被鉴定为导致小籽粒和致死表型的新基因。它编码DNA拓扑异构酶VI（Topo VI）的A亚基，该酶复合物对管理DNA拓扑结构至关重要。拟南芥和水稻中的top6a突变体也表现出严重的发育缺陷，证实了Topo VI复合物在植物生长发育中的核心作用。玉米top6a突变体表现出异常的籽粒结构和致死性，凸显了进一步研究其背后机制的必要性。
