一种双位点响应型荧光探针，用于在活细胞、斑马鱼和拟南芥中高选择性检测和成像ONOO?离子

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A dual-site responsive fluorescent probe for highly selective detection and imaging of ONOO? in living cells, zebrafish, and Arabidopsis thaliana

过氧化亚硝酸盐检测荧光探针XTNOP的理性设计与多体系应用研究。通过整合二苯磷酸酯和色酮阳离子双反应位点，成功开发出具有绿色荧光turn-on特性的新型探针，检测限达52 nM，响应时间40分钟，在细胞、斑马鱼及拟南芥根系中实现精准成像。

　　

Jin Zhao|Ruochen Cai|Peng Liu|Qingjian Dong|Qi Sun

湖北省轻工业技术研究院，中国湖北省武汉市430070

摘要

过氧亚硝酸盐（ONOO^?）是动物和植物系统中氧化应激途径中的关键信号分子。因此，准确监测ONOO^?对于理解人类疾病进展以及评估植物生长和生理状态至关重要。然而，现有的ONOO^?荧光探针主要应用于生物医学领域，关于植物系统的研究非常少。为了解决这一局限性，我们合理设计了一种双位点响应荧光探针XTNOP，该探针结合了二苯基磷酸盐和铬烯鎓阳离子作为反应位点，能够通过绿色荧光增强信号来高度选择性地检测ONOO^?。XTNOP表现出优异的传感性能，包括快速响应时间（40分钟）、显著的荧光增强（25倍）和低检测限（52纳摩尔）。由于其良好的生物相容性，XTNOP能够在活细胞和斑马鱼中成像内源性和外源性ONOO^?。值得注意的是，该探针还被用于监测拟南芥根部的ONOO^?水平。总体而言，这些发现表明双位点响应设计是一种新颖且有效的策略，可以开发出适用于动物和植物系统的荧光探针。

引言

过氧亚硝酸盐（ONOO^?）是一种重要的活性氧（ROS），由超氧阴离子和一氧化氮反应生成[1]、[2]、[3]、[4]。它作为重要的内源性信号介质，参与动物和植物系统的信号转导途径和代谢过程[5]、[6]、[7]。在生理条件下，细胞内的ONOO^?受到严格调控，维持在低纳摩尔水平，这在氧化还原信号传导中起着关键作用[8]、[9]、[10]、[11]。然而，ONOO^?水平的失调可能导致过度的氧化和硝化应激，从而造成细胞和组织损伤[12]、[13]、[14]。升高的ONOO^?与多种人类疾病的发病机制有关，包括癫痫[15]、糖尿病[16]、癌症[17]和肝损伤[18]、[19]，同时也与植物对非生物胁迫的反应密切相关[20]、[21]、[22]、[23]。因此，开发有效的原位和实时监测活系统中ONOO^?水平的策略对于疾病诊断和阐明植物对非生物胁迫的响应机制具有重要意义。

在已开发的传感策略中，基于荧光探针的成像和检测已被广泛用于分析多种生物标志物，包括离子、小分子和酶，无论是在体外还是体内[24]、[25]、[26]。这种方法具有多种内在优势，如非侵入性、高空间和时间分辨率、优异的灵敏度和良好的选择性[27]、[28]、[29]。迄今为止，已经报道了多种ONOO^?荧光探针[30]、[31]、[32]、[33]，研究主要集中在活细胞和人类疾病诊断模型中对ONOO^?的监测[34]、[35]、[36]、[37]。相比之下，ONOO^?荧光探针在植物系统中的应用仍然很少，特别是在将内源性ONOO^?水平与植物生长和生理状态相关联方面[38]、[39]、[40]。因此，为了扩大ONOO^?荧光探针的应用范围，我们设计了一种新型探针，用于在动物和植物模型中敏感地检测和成像ONOO^?。

在这项工作中，我们合理设计了一种新的过氧亚硝酸盐响应探针XTNOP，通过整合ONOO^?反应位点（二苯基磷酸盐和铬烯鎓阳离子），从而提高了其对ONOO^?的选择性。如图1所示，传感机制涉及XTNOP与ONOO^?反应后二苯基磷酸盐键的初始断裂，生成中间体XTNOH。XTNOH中的铬烯鎓部分进一步被ONOO^?氧化断裂，生成最终产物XTNOP-ONOO^{?。由于二苯基磷酸盐部分的强吸电子效应，XTNOH的荧光被淬灭，使XTNOP在红色区域几乎无荧光。与ONOO?反应后，XTNOP-ONOO?的形成导致明显的绿色荧光信号，使得XTNOP能够通过荧光增强模型检测ONOO?。得益于双反应位点设计策略，XTNOP在多种竞争性ROS干扰下对ONOO?表现出优异的选择性。最重要的是，XTNOP已成功应用于活细胞、斑马鱼和拟南芥中内源性和外源性ONOO?的可视化与监测，显示出其在人类疾病诊断和阐明植物非生物胁迫响应方面的潜力。}

材料与设备

本研究中使用的所有化学试剂均购自上海泰坦科技有限公司，纯度为分析级。¹H NMR和¹³C NMR光谱分别使用Bruker Avance III光谱仪在400 MHz和101 MHz下记录。高分辨率质谱（HRMS）使用Agilent 1100系列仪器进行。紫外吸收和荧光发射光谱使用Spectramax M2（Molecular Devices，美国）记录。所有荧光图像均

XTNOP对ONOO^?的光谱响应

为了评估XTNOP对ONOO^?的响应性，进行了紫外-可见光吸收和荧光光谱研究。如图1A所示，自由态的XTNOP在550 nm处显示出一个明显的吸收峰，对应其紫色溶液。与ONOO^?孵育后，550 nm处的峰消失，同时出现一个新的吸收峰（400 nm），颜色从紫色变为黄色，表明XTNOP与ONOO^?发生了反应。

结论

总结来说，我们合理构建了一种荧光探针XTNOP（λ_ex = 400 nm/λ_em = 500 nm），该探针结合了双ONOO^?反应位点（二苯基磷酸盐和铬烯鎓阳离子），从而提高了对ONOO^?的选择性和特异性。所提出的双位点反应机制得到了HRMS分析的明确支持。XTNOP在40分钟内迅速响应ONOO^?，通过荧光增强模型实现高达25倍的荧光增强，并具有低检测限

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（编号：21804102）和石油和化工行业新型生物质基环境和能源材料重点实验室开放项目（编号：BEEA0001）的支持。