《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Comparative analysis of IR and Raman spectra of lyophilized human and bovine collagens types I and III
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胶原蛋白类型I和III的振动光谱分析及氨基酸组成比较，通过极化拉曼和红外光谱结合密度泛函理论模拟，验证了主要特征峰并提出了新的定量区分指标：苯丙氨酸峰1004 cm?1与816 cm?1峰强度比。
K.A. Okotrub|I.V. Zaytseva|A.N. Omelchenko|E.A. Dobrynina|N.V. Surovtsev
俄罗斯科学院自动化与电测量研究所，新西伯利亚 630090，俄罗斯
摘要
胶原蛋白是结缔组织的主要结构蛋白。虽然所有胶原蛋白都具有类似的三螺旋结构，但不同类型的胶原蛋白具有不同的功能，其组成也是健康的重要指标。振动光谱技术被认为是非侵入性地区分胶原蛋白类型的有前景的工具。然而，许多研究缺乏严格的光谱学基础来解释胶原蛋白光谱，包括峰的归属以及未与胶原蛋白类型相关的副作用的考虑。为了解决这一不足，我们同时分析了偏振拉曼光谱和红外光谱。将光谱结果与针对含有胶原蛋白三螺旋中最常见氨基酸序列的三肽和四肽的密度泛函理论模拟结果进行了比较。我们验证了最常见胶原蛋白峰的解释，并对之前被忽略的峰提出了新的归属。通过比较I型和III型胶原蛋白以及分析这些蛋白质中的氨基酸含量，我们发现区分I型和III型胶原蛋白最明显的光谱标志是苯丙氨酸峰（1004 cm?1）的强度比，建议将其强度归一化为816 cm?1处的峰强度。这一指标对构象状态的变化和其他蛋白质无关的杂质的影响较为不敏感。
引言
胶原蛋白是哺乳动物体内最丰富的蛋白质，是结缔组织的主要成分。它们在皮肤病学[1]和再生医学[2][3]中得到广泛应用，特别是在组织生物工程[4]中作为材料。I型和III型胶原蛋白是最常见的胶原蛋白类型。I型胶原蛋白是各种结缔组织中细胞外基质的主要结构成分，为皮肤、肌腱、韧带、骨骼和纤维软骨提供机械强度[5]。III型胶原蛋白是皮肤、器官、血管和肌肉骨骼结构中细胞外基质的组成部分[5]。I型胶原蛋白通常与III型胶原蛋白共存，两者比例的变化与皮肤弹性和再生能力的变化[3]以及扩张型心肌病的发展[6]有关。
胶原蛋白的结构组织与大多数蛋白质有根本不同，因为它由三条通过氢键连接的肽链组成，这些氢键主要存在于甘氨酸（Gly）和脯氨酸（Pro）之间。I型胶原蛋白由两条α-1(I)链和一条α-2(I)链组成，而III型胶原蛋白由三条相同的α-1(III)链组成。这三条多肽链组装成三螺旋结构，通常称为胶原螺旋。在三螺旋形成之前，肽链会经历两种修饰：羟基化和糖基化[7]。羟基化将某些赖氨酸（Lys）和脯氨酸（Pro）残基转化为5-羟基赖氨酸（Hyl）和羟基脯氨酸（Hyp）。在糖基化过程中，半乳糖或葡萄糖-半乳糖残基会连接到Hyl的羟基上。在蛋白质形成的早期阶段，三螺旋的末端还包含特定于胶原蛋白类型的结构，此时该分子被称为前胶原蛋白。这些末端区域在成熟为原胶原蛋白的过程中既具有信号传导作用，也起到排列作用[8]。原胶原蛋白在成熟过程中大部分会被切割掉，只保留短的末端肽段，这些末端肽段通常也会在使用胃蛋白酶从组织中提取胶原蛋白时被去除。尽管末端肽段的切割可以保持胶原蛋白的三螺旋构象，但完全去除这些末端肽段会导致分子堆积无序、重组材料失去特征性的带状纤维结构，并显著增加溶解度[9]。
红外光谱和拉曼光谱方法通常用于区分不同类型的胶原蛋白[10][11][12][13]，并研究它们在不同条件下的变化[11][14][15][16]。许多红外光谱研究仅关注酰胺模式[17][18][19]。有一些优秀的综述[20][21]和实验论文[22][23]对各种胶原蛋白和组织的光谱线进行了解释。不幸的是，有时一篇论文会引用早期的研究，而那篇早期研究又引用更早的研究，从而形成了一条引用链。然而，在这条引用链的起始处，原始来源可能缺乏足够的证据来支持其结论，或者基于假设。此外，许多研究没有考虑偏振和杂质的影响[11][24][25][26]。
在这项工作中，我们对所有氨基酸应用了寡肽建模来解释胶原蛋白光谱。我们首次比较了模拟和实验得到的拉曼峰的退极化比率，并比较了胶原蛋白拉曼光谱和红外光谱中振动模式的活性。这使我们能够更新对胶原蛋白光谱的解释。我们还对人源和牛源I型和III型胶原蛋白的氨基酸含量进行了红外光谱和拉曼光谱的比较分析，以寻找可用于区分不同类型胶原蛋白的光谱指标。我们还研究了可能引入与胶原蛋白类型无关的测量光谱差异的各种外部因素的影响。
材料
我们从Imtek（俄罗斯）购买了四种冻干胶原蛋白样品：牛源胶原蛋白BC11-C（B1）和BC33-C（B3），人源胶原蛋白HC11（H1）和HC33（H3）。根据制造商的信息，这些胶原蛋白是通过稀醋酸处理并经过胃蛋白酶处理后从胎盘中提取的。样品中胶原蛋白的纯度为98%。具体来说，B1和H1样品中I型胶原蛋白含量超过90%，III型胶原蛋白含量低于10%；B3和H3样品中I型胶原蛋白含量也超过90%
胶原蛋白结构与振动光谱
我们首先研究了所研究胶原蛋白的一级结构。由于这些蛋白质是通过胃蛋白酶消化从组织中分离出来的，因此应该不含与前胶原蛋白和末端肽段相关的末端区域。胶原蛋白一级结构的特征是其特有的重复序列基序，其中甘氨酸（Gly）每三个氨基酸中出现一次，使其成为最丰富的残基（图1）。脯氨酸（Pro）和丙氨酸（Ala）是其后的主要残基
结论
我们分析了I型和III型胶原蛋白的偏振拉曼光谱和红外光谱的特征，并对不同类型、物种和构象状态的胶原蛋白进行了比较分析。
为了更精确地解释胶原蛋白的红外光谱和拉曼光谱，我们使用了包含所有相关氨基酸（包括羟基脯氨酸、羟基赖氨酸和Hyl-Gal-Glc）的四肽和三肽的建模。我们不仅分析了峰的强度和频率，还
资助
本工作得到了俄罗斯科学基金会（授权号：25-12-00083）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
实验在IA&E SB RAS（新西伯利亚，俄罗斯）的“气体和凝聚态物质高分辨率光谱”多访问中心进行。
