《BMC Genomics》：Sensitive, flexible, and affordable serum RNA sequencing for pathogen detection on the Oxford Nanopore platform
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这篇综述中心思想在于，针对宏基因组测序在病原体检测中因宿主核酸丰度过高而导致灵敏度低的核心问题，提出并优化了一种结合序列非依赖性单引物扩增（SISPA）与杂交法去除高丰度序列（DASH）的低成本方法。该方法可在牛津纳米孔（ONT）平台上实现血清样本中微生物RNA的PCR级别灵敏度检测，显著优于现有商业宿主去除方案，为资源有限地区的人畜共患病监测提供了高效、灵活且经济的解决方案。
背景
病原体测序已成为公共卫生监测和疾病控制的基石。传统的靶向方法（如PCR扩增子测序）尽管灵敏，但需预知病原体信息，且无法有效检测共感染或新发病原体。宏基因组测序作为非靶向方法，能克服这些局限，但其在临床样本中的应用面临一个主要挑战：宿主核酸的过度存在会严重降低病原体检测的灵敏度。商业宿主去除试剂盒通常价格昂贵且仅限于特定物种，阻碍了其在人畜共患病负担最重的资源有限地区的应用。
材料与方法
研究旨在优化并整合SISPA与DASH技术，建立一种适用于牛津纳米孔平台的低成本宏基因组方案。首先，使用人血清样本，并掺入已知浓度的病毒培养上清液或临床样本中的病毒进行评估。DASH（杂交法去除高丰度序列）是一种基于CRISPR/Cas9的宿主去除方法，通过设计针对人源高丰度RNA（如核糖体RNA (rRNA)、线粒体基因ATP6、ND4等）的引导RNA (sgRNA)，引导Cas9核酸酶对其进行切割去除。研究中重新设计了sgRNA，以避免对已知病毒（噬菌体除外）的脱靶效应，并评估了对血清中常见细胞病原体（细菌、真菌等）16S/18S rRNA的可能脱靶切割。样本制备流程包括：从200 μL掺毒血清中提取核酸，经TURBO DNase处理去除DNA，随后进行RNA变性、逆转录（RT）、第二链合成（使用Klenow片段 (3′?5′ exo-)）、DASH宿主去除、PCR扩增（采用带有牛津纳米孔测序接头的自定义条形码引物，即PCR条形码法）、文库构建，最后在R10.4.1流通池上进行24-48小时的ONT测序。数据处理包括碱基识别、质量过滤、比对及深度分析。
结果
- 1.
DASH设计及其表现：重新设计的DASH sgRNA面板有效针对人源rRNA和线粒体转录本，同时避免了病毒库中的脱靶。与商业试剂（如Qiagen的FastSelect -rRNA Reagent）相比，DASH在去除宿主RNA方面表现更优，能将rRNA水平降至1%或更低，从而显著提高病毒（如海豹瘟病毒 (PDV)）的检测信号。研究还发现，单独的DASH效果不佳，必须与TURBO DNase联用才能实现最佳病毒检测灵敏度，这表明血清中存在大量非靶向的、低丰度的宿主DNA。
- 2.
提取前核酸酶处理的局限性：与DASH+TURBO DNase联用相比，提取前使用核酸酶（Benzonase和微球菌核酸酶）处理不仅对宿主去除效果有限（尤其是对线粒体RNA），还可能降解临床样本中未受保护的病毒RNA（如登革热病毒 (DENV)），导致检测灵敏度大幅下降（Ct值增加可达Δ14.5）。高速离心（15,000 g）可部分去除与线粒体相关的16S rRNA。
- 3.
逆转录前后温度的关键影响：研究发现，为检测双链RNA (dsRNA) 病毒（如轮状病毒、正呼肠孤病毒），必须在逆转录前引入95°C的高温变性步骤，这可使检测灵敏度提高数百倍。此外，逆转录后的温度（即酶失活温度）对病毒检测和宿主去除也有显著影响，95°C的变性效果优于85°C。结合使用耐热RNase H来降解逆转录杂交体中的RNA，能获得更优且与GC含量无关的性能。
- 4.
PCR条形码 vs. 连接条形码：与传统的连接后加条形码方法相比，在SISPA PCR过程中通过引物引入自定义条形码（PCR条形码法），虽然PCR产量降低约5倍，但能获得更长的病毒序列读长、减少实验内污染风险，并对某些病毒和宿主转录本的检测产生偏向性（倾向于保留更长的分子）。
- 5.
DASH方案的优化：研究表明，在第二链合成反应后不进行磁珠清洗，直接加入白蛋白缓冲液进行DASH反应（直接DASH）是可行的，对病毒检测灵敏度影响不大，但会轻微降低对rRNA的去除效率。通过增加Cas9浓度（3倍）和缩小Klenow反应体积（至30 μL），可以减轻这种效率损失。省略蛋白酶K对Cas9的失活步骤则不推荐，因其会负面影响去除效率、读长和部分非去除宿主转录本的检测。
- 6.
降低检测成本的尝试：研究评估了多种更经济的试剂替代方案，结果支持用Maxima H Minus替代Superscript IV作为逆转录酶，用Klenow Fragment (3′?5′ exo-)替代Sequenase 2.0进行第二链合成，用TaKaRa LA聚合酶替代AccuTaq LA进行PCR。此外，使用Macherey Nagel的NucleoSpin病毒试剂盒提取RNA，在调整裂解液和乙醇用量后，其性能与更昂贵的Qiagen试剂盒相当甚至更优。
- 7.
SISPA 2.0协议的性能基准测试：基于上述优化，形成了新的SISPA 2.0协议。成本分析显示，处理24个样本/流通池时，SISPA 2.0的成本（59欧元/样本）比原始SISPA结合FastSelect的方案（146欧元/样本）低2.5倍。灵敏度测试表明，在约0.6 Gb/样本的测序深度下，SISPA 2.0可稳定检测到低至100拷贝/mL的HIV，并能从5000拷贝/mL的样本中获得近全基因组覆盖（深度≥20×）。其灵敏度分别比原始SISPA（无论是否使用FastSelect）高约32倍和7.7倍，比另一种常用方法SMART-9N结合FastSelect高2.7倍。
讨论
本研究成功将DASH整合到SISPA工作流中，创建了SISPA 2.0协议。该协议不仅灵敏度显著高于现有商业宿主去除方法，而且成本大幅降低，并具有高度的物种适应性。DASH相比提取前核酸酶处理更可靠、有效。研究强调了逆转录前后高温步骤对dsRNA病毒检测和整体灵敏度的重要性。采用PCR条形码法有助于减少污染并获得更长读长。尽管通过降低磁珠比例可实现一定程度的病毒富集，但不建议在未知病原体的宏基因组学中常规使用，以免丢失小病毒或片段。协议简化（如直接DASH）和成本控制（更换试剂）的尝试取得了积极成果。最终，SISPA 2.0展现出了与PCR相当的检测灵敏度，是一种真正非靶向的、适用于新病毒发现的宏基因组方法，尤其适合在全球范围内，特别是资源有限地区，用于人类病原体诊断和人畜共患病研究。研究的局限性包括未能测试所有修改组合的相互作用、DASH面板最初并非为细胞病原体诊断优化，以及仍需进行正式的临床验证。
结论
本研究提出的宏基因组方法，能够以PCR级别的灵敏度检测人血清样本中的微生物RNA，并且可以通过内部设计sgRNA，适配任何物种和样本类型。由于其低成本、高灵敏度和灵活性，该技术有潜力在全球范围内广泛应用于人类病原体诊断和人畜共患病研究领域。
