《Exploration》：Immunosuppressive Microenvironment Reprogramming by Synergistic Sonodynamic Therapy of Phthalocyanine-MOF Hybrids for Hepatocellular Carcinoma
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本文介绍了一种新型酞菁-金属有机框架杂化物（Pc@Zr-MOF）在肝细胞癌（HCC）治疗中的应用。该研究通过增强超声能量转换效率，产生大量活性氧（ROS）直接杀伤肿瘤细胞，并利用单细胞RNA测序揭示了其可重塑肿瘤免疫微环境，促进M1型巨噬细胞极化与细胞毒性T细胞浸润，为克服HCC缺氧与免疫抑制、实现精准治疗提供了新策略。
引言
肝细胞癌（HCC）是全球范围内普遍且致死率高的恶性肿瘤。多数患者确诊时已失去手术机会，而射频消融、经导管动脉化疗栓塞等现有局部疗法对正常肝组织有损伤且疗效不精确。近年来，靶向药物和免疫疗法发展迅速，但由于HCC肿瘤异质性高，对免疫治疗的反应差异巨大。声动力疗法（SDT）作为一种非侵入性的精准治疗手段，利用声敏剂在超声作用下产生活性氧（ROS）杀伤肿瘤，为局部治疗和重塑免疫抑制性肿瘤微环境（TME）带来了希望。然而，SDT的临床应用受限于有效水溶性声敏剂的缺乏以及超声能量转换效率低等问题。同时，SDT局部产生的ROS能否逆转HCC缺氧微环境导致的治疗耐受并调节免疫细胞分化与浸润尚不清楚。
金属有机框架（MOFs）因其多孔性和高负载能力成为有潜力的声敏剂载体，但其水溶性和生物相容性有待改善。酞菁类化合物因其卟啉环结构是良好的光敏剂和声敏剂，但其生物相容性和光稳定性限制了应用。本研究设计了一种新型的酞菁-锆基MOF杂化物（Pc@Zr-MOF），旨在通过协同SDT治疗HCC，利用增强的ROS产生逆转缺氧耐受和免疫抑制状态。
结果
2.1 HCC免疫抑制亚群的鉴定与Pc@Zr-MOF的合成
免疫治疗对HCC的疗效差异大，与肿瘤细胞的高度异质性有关。通过单细胞测序分析，将低反应性肿瘤细胞分为八个不同亚群。为重塑肿瘤细胞集群和微环境，需设计策略减少其中的免疫抑制细胞亚群比例。本研究合成了具有良好水溶性的Zr-MOF，并用聚乙二醇（PEG）进行表面修饰以保证溶液稳定性，然后将锌酞菁（Zn-Pc）负载到Zr-MOF的孔道中作为声敏增强剂，形成Pc@Zr-MOF。负载率经计算为34%。扫描电镜和透射电镜表征显示了其形貌，元素分布分析证实了Zn-Pc在MOF表面的负载。动态光散射显示其平均流体动力学尺寸约为100纳米，电位测试显示了逐步合成中溶液电位的变化。X射线衍射、傅里叶变换红外光谱和核磁共振氢谱分析均证实了Zn-Pc的成功负载。溶液稳定性与溶血测试表明该体系具有良好的生物相容性。
通过自旋极化密度泛函理论计算，研究了该复合体系在超声作用下的催化反应可行性。基于压电原理，Pc@Zr-MOF复合结构在超声作用下产生持续的电子-空穴对迁移与分离，从而实现高效的1O2和羟基自由基（•OH）生成。
2.2 Pc@Zr-MOF对HCC的体外体内生物效应与治疗效果
为评估细胞摄取效率，荧光显微镜观察显示，与衍生物水溶液相比，经Pc@Zr-MOF处理的细胞荧光强度显著更高，表明其具有更高的细胞摄取率，这对确保声动力疗法所需的细胞内声敏剂浓度至关重要。细胞计数试剂盒-8（CCK-8）实验表明，在没有超声时，Pc@Zr-MOF细胞毒性极低，显示高生物相容性；但当与超声结合时，细胞活力显著降低，证明了其协同诱导癌细胞死亡的能力。活/死细胞荧光染色进一步证实，经Pc@Zr-MOF和超声处理的组别中死细胞比例更高。使用DCFH-DA染色评估细胞内ROS生成，发现Pc@Zr-MOF加超声组别的荧光强度显著高于其他组，且ROS产生随超声暴露时间延长而增加。
在异体移植HCC小鼠模型中评估了Pc@Zr-MOF的体内抗肿瘤疗效。实验表明，经Pc@Zr-MOF与PD-L1抑制剂联合超声治疗的组别，肿瘤体积和重量均显著小于其他组，且小鼠体重无显著下降，表明其系统毒性低。免疫组化分析显示，该组肿瘤Ki-67染色减少（表明增殖降低），CD3+T细胞和CD11b+髓系细胞浸润增加。免疫荧光成像也揭示了肿瘤微环境的显著重塑。这些结果表明，Pc@Zr-MOF介导的SDT不仅能通过ROS直接杀死肿瘤细胞，还能刺激免疫系统对抗残余癌细胞。
2.3 Pc@Zr-MOF治疗HCC的单细胞图谱分析
为阐明治疗效果的细胞分子机制，对处理后的肿瘤进行了单细胞RNA测序。与单用免疫治疗的对照组相比，经增强SDT处理的肿瘤组织细胞群表现出显著的亚群差异。差异基因表达分析显示，肿瘤细胞中增殖相关基因（如MKI67， TOP2A）显著下调，促凋亡基因（如CASP3， BAX）上调，表明Pc@Zr-MOF有效抑制肿瘤生长并诱导凋亡。火山图分析进一步显示免疫激活基因（如IFNG， CXCL10）上调和免疫抑制基因（如TGFB1， VEGFA）下调。比较细胞亚群比例发现，细胞毒性T细胞和自然杀伤（NK）细胞增加，同时调节性T细胞（Tregs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）减少，表明肿瘤微环境向免疫刺激状态转变。基因集富集分析支持了这些发现，显示免疫相关通路富集而促肿瘤通路被抑制。
2.4 SDT通过巨噬细胞重编程与极化改变HCC肿瘤免疫微环境
对肿瘤组织进行更深入的免疫库测序分析后发现，Pc@Zr-MOF介导的SDT后，巨噬细胞亚群发生了显著的重编程。通过基因表达谱鉴定了三个主要的巨噬细胞亚群：Igfbp4、Ccl8和Tgfbi亚群。研究发现M1型巨噬细胞比例显著增加，其特征是促炎细胞因子和抗原呈递分子高表达；同时M2型巨噬细胞比例显著下降，其特征基因下调。伪时间轨迹分析揭示了巨噬细胞表型的动态重编程，细胞经历分叉分化：一支向促炎M1极化，另一支则偏离免疫抑制M2状态。进一步的免疫荧光分析显示，经增强SDT治疗后，HCC组织中抗原呈递标记CD1c和T细胞激活标记CD80的表达显著增加，表明极化的M1细胞和抗原呈递细胞有效逆转了局部肿瘤微环境。巨噬细胞亚群差异基因的伪时间序列分析显示，在巨噬细胞重编程过程中，抗原呈递相关基因表达倾向于过表达，而抑制基因表达被抑制。
为了解T细胞在肿瘤微环境中的变化与浸润，对T细胞受体相关细胞进行了注释和比较。T淋巴细胞被注释为四个亚群。细胞分化的伪时间序列分析揭示了T细胞分化的终点远比巨噬细胞复杂。仔细比较T细胞及其亚群治疗前后的转录组差异基因发现，核糖体相关基因呈下调趋势，这可能是增强声动力疗法抑制肿瘤分化和增殖的主要方式之一。进一步的肿瘤组织免疫荧光切片分析显示，树突状细胞（DC）被巨噬细胞和T细胞调节激活，随后富集于肿瘤组织中，帮助机体获得长期抗肿瘤免疫力。通过T细胞亚群分化时间的伪时间分析发现，在SDT刺激下，CD8+T细胞表现出更早的分化趋势，而调节性T细胞表现出较晚的分化趋势。流式细胞术验证了测序显示的细胞集群变化。
2.5 ROS诱导的差异基因富集分析与细胞通讯交互
通过分析SDT中差异基因的富集通路，观察到ROS主要影响HCC组织内细胞器相关基因的表达。具体而言，ROS介导的胞质蛋白表达调控在调节细胞内和细胞外通讯中起关键作用，最终影响肿瘤细胞分化和增殖。这种调控机制凸显了ROS不仅在直接损伤肿瘤细胞，而且在重塑细胞微环境以抑制肿瘤进展方面的双重作用。此外，抗原呈递细胞（APCs，包括M1巨噬细胞和活化的树突状细胞）的激活被发现在维持抗肿瘤免疫力中起关键作用。这些APCs通过激活细胞毒性T细胞来增强ROS基SDT的疗效。富集分析进一步揭示，ROS主要通过调节核糖体相关基因来影响T细胞，这些基因对于促进CD8+T细胞的分化和成熟至关重要。这表明ROS不仅直接靶向肿瘤细胞，还通过促进细胞毒性T细胞的发育来增强适应性免疫反应。此外，观察到SDT前后细胞通讯模式的差异，揭示了肿瘤细胞亚群之间不同的分化趋势。倾向于凋亡的肿瘤细胞亚群表现出活跃的细胞通讯，而其他亚群则呈现程序性细胞死亡表型。
讨论
HCC肿瘤具有显著的内部异质性和免疫微环境抑制，导致免疫治疗反应差异和低反应性。尽管SDT策略近年来被引入肿瘤精准治疗，但仍存在一些未解决的问题和需要阐明的机制。Pc@Zr-MOF的开发在协同SDT治疗HCC中重塑了细胞亚群分化和肿瘤微环境。本研究结果表明，这种新型杂化材料不仅能增强ROS生成，还能调节肿瘤免疫微环境，从而改善治疗效果。Pc@Zr-MOF促进M1巨噬细胞极化和细胞毒性T细胞激活的能力，突显了其克服HCC免疫抑制特性的潜力。这种直接肿瘤细胞杀伤与免疫调节相结合的双重作用机制，为解决当前疗法的局限性提供了一种有前景的策略。
近年来MOF基SDT的进展主要集中于提高ROS产量，而我们的Pc@Zr-MOF体系独特地将高效的声敏化与单细胞分辨的免疫重编程相结合。与先前表现出有限缺氧适应性的常规卟啉-MOFs不同，我们的设计整合了类过氧化氢酶活性和代谢调节以克服肿瘤特异性屏障。这种多模式方法为SDT平台建立了新范式，即通过机制理解共同优化材料特性和免疫学结果。我们的Pc@Zr-MOF设计原理源于克服HCC治疗中两个关键局限性的需要：缺氧诱导的治疗抵抗和免疫激活不足。与先前的MOF基声敏剂相比，我们的系统由于Zr-MOF的优化声学特性和Zn-Pc红移吸收的更深组织穿透性，表现出更优的深度穿透性。该平台与免疫检查点抑制剂或抗血管生成疗法联合显示出强大潜力。重要的是，这项工作首次将单细胞分辨免疫分析与MOF基声敏剂设计相结合，推动了SDT领域发展，为理解SDT诱导的免疫调节机制设立了新标准。
结论
本研究展示了Pc@Zr-MOF作为新型SDT剂治疗HCC的变革潜力，它结合了酞菁和金属有机框架的独特特性，在超声激活下增强ROS生成，同时重编程肿瘤免疫微环境。通过解决缺氧诱导的抵抗和免疫抑制等关键挑战，Pc@Zr-MOF实现了直接肿瘤细胞杀伤和免疫细胞重编程的双重作用机制，通过M1巨噬细胞极化、细胞毒性T细胞浸润和抑制免疫抑制细胞群，将肿瘤微环境重塑为更具免疫刺激性的状态。这项工作不仅推动了SDT领域的发展，也为将其与免疫调节策略（如免疫检查点抑制剂或过继性细胞疗法）结合以增强抗肿瘤免疫开辟了新途径。未来的研究应侧重于优化递送和激活参数，在临床试验中评估长期疗效和安全性，并利用单细胞RNA测序的见解探索在其他实体瘤中的应用。最终，这项研究代表了朝着个性化、多模式癌症治疗迈出的重要一步，这种治疗利用物理和生物学机制实现持久的治疗结果，为晚期HCC及其他疾病患者带来了新希望。
