一种基于纳米体的去蛋白系统，用于定向敲低盘状粘菌（Dictyostelium discoideum）中的特定蛋白质

《BMC Molecular and Cell Biology》：A nanobody-based degron system for targeted protein knockdown in Dictyostelium discoideum

本研究开发了一种基于ALFA标签和纳米抗体的条件性蛋白降解系统，通过靶向Skp1-Cullin-F-box复合体实现细胞类型特异性蛋白降解，结合IAA诱导的AID2系统验证了其效应用于黏菌功能研究。

　　

摘要

背景

细胞黏菌Dictyostelium discoideum是研究细胞生物学和发育生物学基本过程的常用模型系统。虽然通过同源重组进行基因敲除以及使用CRISPR/Cas9进行基因组编辑等遗传工具在D. discoideum中已经非常成熟，但用于条件性功能丧失研究的高效方法仍然有限。在这里，我们基于ALFA标签蛋白招募到Skp1-Cullin-F-box (SCF)复合体的机制，为D. discoideum开发了一种基于纳米抗体的降解系统。

结果

通过表达与D. discoideum的FbxD F-box结构域融合的抗ALFA纳米抗体（NbALFA）（“dictyGrad-ALFA”），能够高效降解带有ALFA标签的组蛋白H1。通过在预柄细胞和预孢子细胞特异性基因启动子下表达dictyGrad-ALFA，实现了细胞类型的特异性靶向。此外，针对腺苷酸环化酶A (ACA)的靶向作用导致了预期的聚集缺陷表型，验证了dictyGrad-ALFA介导的蛋白质降解效果。细胞类型特异性的ACA降解虽然延缓了发育进程，但最终仍能形成正常的子实体。我们的ALFA标签方法还与生长素诱导的降解系统2（AID2）结合使用，该系统依赖于NbALFA-mAID与OsTIR-F-box-Skp1A融合蛋白之间的吲哚-3-乙酸（IAA）依赖性结合。我们在预柄细胞中实现了高效的IAA诱导降解；然而，在其他细胞类型中的效率较低。

结论

这些系统共同为在D. discoideum中实现条件性和细胞类型特异性的蛋白质降解奠定了基础，从而能够对生长和发育所必需的基因进行功能分析。

背景

细胞黏菌Dictyostelium discoideum是研究细胞生物学和发育生物学基本过程的常用模型系统。虽然通过同源重组进行基因敲除以及使用CRISPR/Cas9进行基因组编辑等遗传工具在D. discoideum中已经非常成熟，但用于条件性功能丧失研究的高效方法仍然有限。在这里，我们基于ALFA标签蛋白招募到Skp1-Cullin-F-box (SCF)复合体的机制，为D. discoideum开发了一种基于纳米抗体的降解系统。

结果

通过表达与D. discoideum的FbxD F-box结构域融合的抗ALFA纳米抗体（NbALFA）（“dictyGrad-ALFA”），能够高效降解带有ALFA标签的组蛋白H1。通过在预柄细胞和预孢子细胞特异性基因启动子下表达dictyGrad-ALFA，实现了细胞类型的特异性靶向。此外，针对腺苷酸环化酶A (ACA)的靶向作用导致了预期的聚集缺陷表型，验证了dictyGrad-ALFA介导的蛋白质降解效果。细胞类型特异性的ACA降解虽然延缓了发育进程，但最终仍能形成正常的子实体。我们的ALFA标签方法还与生长素诱导的降解系统2（AID2）结合使用，该系统依赖于吲哚-3-乙酸（IAA）依赖性结合之间的NbALFA-mAID与OsTIR-F-box-Skp1A融合蛋白。我们在预柄细胞中实现了高效的IAA诱导降解；然而，在其他细胞类型中的效率较低。

结论

这些系统共同为在D. discoideum中实现条件性和细胞类型特异性的蛋白质降解奠定了基础，从而能够对生长和发育所必需的基因进行功能分析。