《Gut Microbes》：Extracellular vesicles and their RNA cargo facilitate bidirectional cross-kingdom communication between human and bacterial cells
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该综述提出胞外囊泡（EVs）及其RNA货物是介导人类肠道上皮细胞与特定革兰氏阳性和阴性菌（Lacticaseibacillus casei, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis）之间跨物种、双向通讯的关键媒介。文章通过系统研究发现，细菌胞外囊泡（BEVs）可诱导宿主细胞产生显著的、菌种特异性的转录组变化，其RNA货物独立地驱动了部分免疫相关基因（如CCL20, CXCL8）的调控。反之，宿主细胞来源的胞外囊泡（Caco-2 EVs）及其富集的miRNA-192-5p也能与细菌相互作用，并受脂质包裹形式调节。该研究为理解宿主-微生物组稳态与疾病的分子对话机制提供了新框架，并强调了进行情境特异性分析的重要性。
肠道上皮与细菌的跨物种对话：胞外囊泡RNA货物的双向信使作用
Lacticaseibacillus casei, Enterococcus faecalis 和 Proteus mirabilis 产生细菌胞外囊泡，且Caco-2细胞可与之相互作用
为研究细菌胞外囊泡（Bacterial Extracellular Vesicles, BEVs）对宿主细胞的影响，研究首先从三种肠道相关细菌——革兰氏阳性菌Lacticaseibacillus casei（L. casei）和Enterococcus faecalis（E. faecalis），以及革兰氏阴性菌Proteus mirabilis（P. mirabilis）的培养物中分离了BEVs。通过超速离心结合尺寸排阻色谱法（Size Exclusion Chromatography, SEC）纯化后，利用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）和冷冻透射电镜（Cryo-transmission Electron Microscopy, Cryo-TEM）对BEVs进行了表征。L. casei的膜囊泡（Membrane Vesicles, MVs）平均尺寸约为140.0 nm，E. faecalis MVs约为117.1 nm，P. mirabilis的外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles, OMVs）约为115.2 nm。冷冻电镜图像显示它们均为圆形颗粒。由于革兰氏阴性菌OMVs通常含有脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS），研究还对P. mirabilis OMVs的LPS含量进行了定量，证实其存在少量LPS。
接下来，研究利用DiI荧光染料标记BEVs，通过流式细胞术和共聚焦激光扫描显微镜（Confocal Laser Scanning Microscopy, CLSM）观察了Caco-2细胞与BEVs的相互作用。流式结果显示，孵育24小时后，Caco-2细胞对E. faecalis MVs和P. mirabilis OMVs的荧光阳性率均超过96%，而对L. casei MVs的摄取较慢，48小时后阳性率约为82%。共聚焦显微镜观察证实，BEVs能够在Caco-2细胞内积聚，且这种积聚随时间增加，表明BEVs与宿主细胞存在有效相互作用。
BEVs含有不同的RNA种类和数量，与BEVs或其RNA孵育或转染对Caco-2细胞无细胞毒性
研究进一步评估了BEVs对Caco-2细胞活力的影响。将细胞与不同浓度的BEVs孵育24或48小时后，通过细胞活力与细胞毒性检测发现，所有BEVs在测试浓度下均未对细胞活力产生负面影响或增加细胞毒性。值得注意的是，L. casei的MVs甚至在特定条件下显著提升了细胞活力。孵育P. mirabilis的LPS单独也未影响细胞活力。
鉴于BEV相关的RNA被报道可调节宿主细胞反应，研究分析了三种BEVs的RNA含量。结果显示，在相同数量颗粒（5×1010）中，L. casei MVs和E. faecalis MVs的RNA产量相当（约31-33 ng），而P. mirabilis OMVs的RNA含量显著较低（约13 ng）。RNA种类分析揭示了差异化的RNA货物组成：L. casei MVs含有大量小RNA（<200 nt）及一些较大的RNA（约2000 nt）；E. faecalis MVs同时包含小RNA、较大的RNA片段和独特的核糖体RNA；而P. mirabilis OMVs则几乎只携带小RNA。从P. mirabilis OMVs中分离的RNA也检测到少量LPS。
为了评估BEV-RNA的潜在细胞毒性，研究用不同剂量的BEV-RNA转染Caco-2细胞。结果与孵育完整BEVs一致，转染任何剂量的BEV-RNA均未损害细胞活力或增加细胞毒性，单独转染P. mirabilis LPS也未产生影响。
Caco-2细胞的转录组因与BEVs孵育或BEV-RNA转染而发生变化
为了深入探究BEVs及其RNA货物对宿主细胞基因表达的影响，研究对处理不同时间（10小时、24小时、48小时）后的Caco-2细胞进行了RNA测序（RNA-seq）。实验设计确保用于转染的BEV-RNA与孵育实验所用的BEVs来自同批次制备。在总共105个样本的分析中，发现了数千个差异表达基因。其中，孵育BEVs后，差异表达基因数量在24小时达到峰值；而用L. casei MV-RNA和P. mirabilis OMV-RNA转染后，差异表达基因也在24小时最多，但E. faecalis MV-RNA转染在10小时就引起了更强的基因去调控。
通过分析差异表达基因的交集，研究者发现，尽管不同处理条件引起的基因变化存在独特性，但也存在一个较小的基因子集在多个条件或时间点共享，提示可能存在类似的调控事件。
为解析这些差异表达基因涉及的生物学通路，研究进行了过富集分析。结果发现，Caco-2细胞在与L. casei MVs孵育10或24小时后，差异基因显著富集于与炎症反应、趋化性和细胞粘附相关的通路。有趣的是，在孵育48小时后，与趋化性相关的通路富集不再显著，这可能表明细胞对L. casei MVs的反应随时间的延长而减弱。用L. casei MV-RNA转染细胞24小时后，差异基因同样富集于趋化性和细胞粘附等通路。这表明MV-RNA本身足以引发与完整MVs相似的转录组变化。具体分析显示，包括CCL20、CXCL8、CXCL10、CXCL11、IL1B、IL6在内的多种趋化因子和白细胞介素基因，以及模式识别受体基因如NOD2、NLRP1、NLRP9、TLR3、TLR7的表达均发生了变化。
对于E. faecalis，其MVs孵育对免疫相关通路的富集影响较弱，但其MV-RNA在转染10小时后即强烈影响防御反应、细胞粘附和趋化性等通路。对于P. mirabilis，其OMVs孵育显著影响了炎症反应、细胞粘附和趋化性通路，而其OMV-RNA转染对炎症反应相关通路的富集影响则相对较弱。与L. casei类似，E. faecalis和P. mirabilis处理也引起了CCL20、CXCL8、CXCL11等免疫相关基因以及NOD2、NLRP1、TLR3、TLR7等受体基因的表达变化。
考虑到LPS在P. mirabilis OMVs及其RNA中的存在，研究还分析了单独LPS对转录组的影响。结果显示，P. mirabilis LPS引起的差异基因富集的生物学通路与OMVs或OMV-RNA引起的通路存在明显不同。而且，与OMVs或OMV-RNA处理相比，LPS处理对CCL20、CXCL8、CXCL10等关键免疫基因的上调作用较弱或不一致。这表明OMVs及其RNA货物诱导的转录组变化在很大程度上独立于LPS的作用。
细菌与Caco-2来源的胞外囊泡相互作用并影响细菌生长
研究的另一部分是探究细菌能否与宿主细胞来源的胞外囊泡相互作用。为避免胎牛血清（Fetal Calf Serum, FCS）中EVs的干扰，研究使用了在无FCS培养基中培养的Caco-2细胞上清分离的EVs。NTA和冷冻电镜表征显示，这些Caco-2 EVs的平均尺寸约为121 nm，浓度为1.2×1011颗粒/毫升。
将三种细菌与不同浓度的Caco-2 EVs共培养，并监测其生长曲线。结果显示，E. faecalis在较高浓度EVs存在下，其稳定生长期延长。L. casei的生长未受影响，而P. mirabilis在与EVs共培养36小时后，生长受到抑制。为了可视化观察相互作用，研究用PKH26荧光染料标记了Caco-2 EVs，并与细菌共培养后进行共聚焦显微镜观察。对于L. casei和P. mirabilis，仅在细菌附近检测到微弱的EVs荧光信号。相比之下，对于E. faecalis，观察到标记的EVs更频繁地与细菌细胞共定位或在其附近出现。这表明细菌与宿主来源的EVs存在相互作用，且具有菌种特异性。
来自条件培养基和非条件培养基的胞外囊泡具有不同的miRNA表达谱
为了鉴定由Caco-2细胞通过EVs分泌的miRNA，研究采用了比较策略：同时从含有FCS的Caco-2细胞条件培养基和未培养细胞的相同FCS培养基（非条件培养基）中分离EVs。两种来源的EVs在尺寸和浓度上相似。通过蛋白质印迹法（Western blot）验证了EV标志物的存在和细胞标志物的缺失。
随后，对来自条件培养基和非条件培养基EVs的miRNA进行了小RNA测序。层次聚类分析显示，两种来源EVs的miRNA表达谱存在明显区分。差异表达分析共鉴定出716种miRNA。其中，252种miRNA在条件培养基EVs中显著上调，提示它们很可能由Caco-2细胞分泌。相反，74种miRNA在条件培养基EVs中显著下调，表明它们不太可能来源于Caco-2细胞。在条件培养基EVs中丰度显著升高的miRNA中，研究重点发现了miR-192-5p。与来自非条件培养基的EVs相比，miR-192-5p在来自条件培养基的EVs中的丰度增加了约36.4倍，表明它可能是Caco-2 EVs介导信号传递中的一个潜在重要分子。
细菌与miR-192-5p的相互作用具有菌种依赖性，并受脂质体包裹的影响
鉴于miR-192-5p在Caco-2 EVs中高度富集，研究假设其可能对细菌细胞产生功能影响。首先测试了合成miR-192-5p对细菌生长的影响。在含有不同浓度合成miR-192-5p的培养基中培养细菌，结果显示，miR-192-5p对L. casei和E. faecalis的生长无显著影响，但4 μM的miR-192-5p显著增强了P. mirabilis的生长。然而，后续的细菌活力检测表明，这种光密度增加并非源于细菌活力的提升。
接下来，研究用Cy3标记的合成miR-192-5p处理细菌，通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估细菌与该miRNA的关联。结果显示，L. casei和E. faecalis仅显示微弱的荧光信号，而约53%的P. mirabilis呈荧光阳性，且共聚焦图像显示标记的miRNA聚集在细菌细胞附近。这揭示了细菌与miR-192-5p的相互作用存在显著的物种特异性差异。
由于miR-192-5p存在于Caco-2分泌的EVs中，研究进一步探究了miRNA的物理呈现形式（游离或脂质体包裹）是否影响其与细菌的相互作用。使用基于脂质体的递送系统（Lipofectamine? 3000）包裹Cy3标记的合成miR-192-5p。与游离形式相比，脂质体包裹显著改变了细菌对miRNA的检测关联度。对于L. casei和E. faecalis，脂质体包裹形式的荧光阳性细胞比例有所提高；对于P. mirabilis，阳性率高达80%。共聚焦图像也证实了脂质体包裹的miRNA在细菌附近的积聚增加。研究还排除了实验中所用培养基DMEM本身对游离miRNA结合的影响，但发现DMEM可能增强了P. mirabilis与miRNA的相互作用。总之，这些结果表明脂质体包裹可调节细菌对miR-192-5p的可检测性关联。
最后，研究评估了脂质体包裹的miR-192-5p对细菌活力的影响。L. casei在空脂质体存在下活力略有下降，但在含miR-192-5p的脂质体存在下未观察到下降，提示miRNA可能对细菌有潜在保护作用。E. faecalis的活力不受脂质体处理影响。相反，P. mirabilis在接触任何脂质体（空载、含miR-192-5p或含替代核酸poly(A)）后活力均有所增加，表明这是一种不依赖于货物特性的反应。这些发现强调了RNA递送形式在宿主-微生物通讯研究中的重要性。
讨论
该研究将EVs定位为跨物种通讯网络中双向的分子信使，不仅是被动运输者，更是能够选择性地调控跨界受体细胞基因表达和生长行为的主动信使。观察到Caco-2细胞与三种细菌来源BEVs存在时间依赖性和菌种特异性的相互作用，其程度可能与细菌包膜结构（如E. faecalis的细胞壁多糖、P. mirabilis的LPS）有关。BEVs的RNA含量和种类也存在物种差异，P. mirabilis OMVs的RNA含量较低且主要为小RNA。
转录组学数据证实，BEVs可诱导Caco-2细胞发生涉及数千基因的广泛转录变化，富集通路包括免疫信号、炎症反应和趋化性。重要的是，BEV-RNA的单独转染也能引起部分相似的转录变化，这为RNA货物独立贡献于细胞反应提供了机制性证据。具体涉及的基因包括模式识别受体（NOD2, NLRP1, TLR3, TLR7）和多种趋化因子/白细胞介素（CCL20, CXCL8, CXCL10等）。同时，BEVs或BEV-RNA引起的效应与P. mirabilis LPS单独引起的效应存在差异，表明BEVs及其RNA在调控宿主基因表达中具有独特作用。
在相反方向上，研究发现Caco-2来源的EVs可以与细菌（尤其是E. faecalis）相互作用，并影响其生长曲线。通过比较条件与非条件培养基EVs的miRNA谱，成功鉴定出由Caco-2细胞特异性分泌的高度富集miRNA——miR-192-5p。
关于细菌与宿主miRNA的相互作用，研究观察到显著的物种特异性。P. mirabilis显示出最高的miR-192-5p结合水平，且miRNA倾向于聚集在细菌极区，这可能与IV型菌毛介导的核酸摄取机制有关。而革兰氏阳性菌（L. casei, E. faecalis）因细胞壁结构复杂，对游离miRNA的结合较弱。然而，当miR-192-5p被包裹在脂质体中时，其与革兰氏阳性菌的可检测性关联显著增加，提示物理呈现形式（如EVs的脂质双层膜）是调节这种跨界相互作用的关键因素。细菌活力实验进一步揭示了脂质体包装和特定RNA货物对细菌反应的复杂影响。
研究也指出了自身的局限性，包括无法明确区分EVs/miRNA是表面结合还是内化、实验条件简化、以及不同菌种BEVs浓度/RNA量的差异使得直接跨物种比较效应存在困难等。
总而言之，该研究强调了EVs及其RNA货物在宿主-微生物通讯网络中的核心作用，提出了一个双向分子对话的概念模型。这些发现不仅深化了对宿主-微生物组互作机制的理解，也为未来探索EVs作为靶向治疗的可编程载体奠定了基础。在更复杂的实验体系（如体内或疾病条件下）中验证这些相互作用，将是未来研究的重要方向。
