《Gut Microbes》：The role of gut microbes in production of aromatic carboxaldehydes
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本研究建立了一种稳定的同位素稀释液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，首次系统量化了肠道微生物从芳香氨基酸合成的四种芳香羧醛（ArAs：I3A、BA、4HBA、4IA）。研究证实肠道微生物是这些ArAs的主要来源，并揭示克罗恩病（CD）患者粪便中I3A和4HBA水平显著降低。该工作为探索肠道微生物代谢物在疾病中的作用提供了新工具与新视角。
摘要
肠道微生物通过改变可利用的营养物质和产生小分子代谢物，在维持宿主健康中扮演重要角色。吲哚-3-甲醛（I3A）是一种由肠道微生物从芳香氨基酸色氨酸（Trp）合成的芳香羧醛（ArA），其功能与抗肿瘤活性、肠道稳态和代谢综合征密切相关。然而，由于缺乏检测和定量方法，肠道微生物生产其他ArAs的能力及其与宿主健康的关系在很大程度上尚未被探索。本研究开发并验证了一种基于3-甲氧基苯肼（3MPH）衍生化的稳定同位素稀释质谱方法，用于定量来自所有四种芳香氨基酸（除I3A外，还包括苯甲醛（BA）、4-羟基苯甲醛（4HBA）和4-咪唑甲醛（4IA））的ArAs。使用非吸收性抗生素混合物耗竭肠道微生物群后，人和小鼠粪便中的I3A和4HBA水平均降低，而相同处理也降低了人类粪便中的BA和小鼠粪便中的4IA水平。此外，我们鉴定出多种具有在培养物中生产特定ArAs能力的共生菌，并发现与无炎症性肠病（IBD）的对照组相比，克罗恩病（CD）患者（而非溃疡性结肠炎（UC）患者）的粪便中I3A和4HBA水平较低。
引言
肠道微生物通过改变可利用的营养物质和产生小分子与宿主相互作用，在维持健康方面发挥着重要作用。例如，膳食纤维被微生物发酵为短链脂肪酸（SCFAs），与改善宿主代谢和增强调节性T细胞功能相关。此外，作为肠上皮细胞的重要燃料，SCFAs在维持肠道屏障方面起着关键作用。由宿主来源的胆汁酸经微生物修饰产生的次级胆汁酸，对宿主代谢和免疫活动具有广泛影响，并且在IBD个体中观察到胆汁酸稳态紊乱。然而，肠道微生物的代谢潜力在很大程度上仍未得到充分探索。
I3A是一种由肠道微生物从氨基酸色氨酸产生的ArA，通过激活芳香烃受体（AhR），其在抗肿瘤活性、肠道稳态和代谢综合征中的作用已被机制性阐明。此外，苯丙氨酸（Phe）或酪氨酸（Tyr）各自酶促降解衍生的芳香羧醛BA和4HBA在食品调味中发挥作用，并常被确定为某些饮食和健康障碍的潜在生物标志物。然而，肠道微生物从这两种芳香氨基酸以及组氨酸（His）生产羧醛的能力仍有待探索。
本研究开发并验证了一种定量的稳定同位素稀释液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法，该方法基于与3MPH进行衍生化以生成稳定的可电离腙，用于量化ArAs。利用该方法，我们能够可靠地定量小鼠和人类样本中的BA、4HBA、4IA和I3A。我们证明肠道微生物在体内和体外都具有生产特定ArAs的能力，并且与无IBD的对照组相比，CD患者（而非UC患者）的粪便中I3A和4HBA水平较低。
材料与方法
研究方案获得克利夫兰诊所机构审查委员会批准，所有受试者均签署了书面知情同意书。人类粪便样本来自健康志愿者，他们接受了为期7天的口服难吸收抗生素混合物治疗。小鼠研究使用8-10周龄的C57BL/6J小鼠进行，抗生素组小鼠通过饮用水接受抗生素混合物处理四周，对照组则饮用普通水。
本研究开发了一种稳定同位素稀释定量LC-MS/MS方法用于ArAs定量。由于某些ArAs（如BA和4HBA）离子化效率差，因此使用3MPH将其衍生化为稳定的腙。色谱分离在SynergiTM Fusion-RP柱上进行，使用电喷雾电离正离子模式下的多反应监测（MRM）进行检测。该方法在线性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、基质效应、冻融稳定性、自动进样器稳定性和回收率方面均经过验证。
结果
芳香羧醛的定量分析
为研究肠道微生物对ArAs生产的作用，我们首先开发了用于其定量的稳定同位素稀释定量LC-MS/MS方法。优化后的LC-MS/MS条件和色谱分离方法能够有效分离和检测四种ArA-3MPH加合物。方法验证表明，该方法在精密度、准确度、基质效应和稳定性方面表现良好，适用于后续分析。
肠道微生物对ArA产生的影响
为了研究肠道微生物对粪便中ArAs水平的贡献，我们首先在健康个体中测量了使用口服难吸收广谱抗生素混合物（耗竭肠道微生物群）前后粪便中ArAs的水平。抗生素处理导致I3A、BA和4HBA显著降低，表明肠道微生物可能参与了它们的生产。4IA的水平在个体间变化较大，受处理影响不统一。
在小鼠中进行的肠道微生物抑制研究也得到了类似的结果。经过四周抗生素处理的小鼠，其粪便中I3A、4HBA和4IA的水平降低，而BA的水平未受影响。抗生素处理有效抑制了肠道微生物群，表现为总DNA和16S rDNA基因数量的显著减少，以及微生物群落组成的显著改变。
相关性分析显示，在小鼠对照组中，I3A、4HBA和4IA的水平呈强正相关，并且与某些微生物属（如Family_XIII_UCG.001和Dorea）的丰度正相关，与葡萄球菌属（Staphylococcus）的丰度负相关。
接下来，我们通过评估选定共生菌（在人类微生物群中普遍存在和/或已知能产生ArAs）的条件培养基中的ArAs浓度，来鉴定具有生产ArAs能力的特定肠道微生物成员。数据显示，不同细菌物种生产ArAs的能力存在显著差异。例如，几种罗伊氏乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）菌株能产生I3A，有些还能产生4HBA和4IA。詹氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）能产生4IA、4HBA和I3A。多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）菌株能产生大量的BA和4IA。肠球菌属（Enterococcus）物种能产生最高量的I3A和4IA，以及4HBA。所有测试的梭菌属（Clostridia）菌株均未产生高于培养基背景水平的ArAs。研究还揭示了同一物种不同菌株间在生产ArAs的类型和数量上存在显著的菌株水平差异。
芳香羧醛与炎症性肠病
为了确定已鉴定的ArAs在人类疾病中是否发生改变，我们量化了IBD患者和年龄、性别匹配的无IBD对照者粪便中选定ArAs的水平。总体而言，IBD患者粪便中的I3A、4HBA和4IA水平低于对照组，但差异未达到统计学显著性。然而，将IBD患者细分为CD和UC后，发现与对照组相比，CD患者（而非UC患者）的I3A和4HBA水平显著降低。此外，CD患者的I3A水平也显著低于UC患者。I3A和4HBA水平在人类粪便样本中也显示出高度的正相关性。测量的ArA水平与IBD严重程度指数（如CD-PRO2、CDAI、UC-PRO2、CDAI评分或钙卫蛋白）之间未观察到显著相关性。
除了ArAs，我们还测量了其他源自芳香氨基酸的肠道微生物代谢物，除了酪氨酸衍生的4-羟基苯乙酸（4HPA）在CD患者粪便中水平高于非IBD对照外，其余代谢物在各组间均未观察到差异。
通过宏基因组测序和生物信息学分析，我们确定了用于量化ArAs的个体粪便微生物群组成，并进行了微生物类群相对丰度与粪便ArAs水平之间的相关性分析。与对照组相比，CD和UC患者的香农多样性（α-指数）较低。总体β-多样性指数的典型相关分析显示三个亚组存在分离。差异丰度分析揭示了UC患者与对照组相比，Alistipes onderdonkii、Candidatus cibionibacter和Bacteroides stercoris的丰度降低，而Fusicatenibacter saccharivorans丰度增加。在CD患者与对照组相比中，Coprococcus comes、Bacteroides caccae、Collinsella aerofaciens、Clostridiales family和Blautia caecimuris的丰度较低。所有四种ArAs均与Bacteroides unformis和Blautia faecis的丰度呈正相关。
讨论
肠道微生物产生的小分子正成为调节宿主健康和疾病易感性的重要介质。IBD与肠道微生物失调相关，其特征是微生物多样性减少以及共生菌与潜在病原体之间的平衡被破坏。肠道微生物组成的变化也会导致微生物产生的代谢物改变，从而可能在IBD发病机制中发挥作用。
本研究使用3MPH将ArAs“捕获”成可电离的腙，作为一种通过稳健、可靠且可重复的稳定同位素稀释LC-MS/MS方法检测和量化它们的策略。该方法应成为进一步推进ArAs在宿主健康背景下研究以及探索其与宿主中肠道微生物驱动代谢联系的宝贵工具。通过人类和动物研究以及细菌培养，我们证明了肠道微生物具有生产除I3A之外的其他ArAs的能力。具体而言，我们发现使用非吸收性抗生素耗竭细菌会导致人类粪便中I3A、BA和4HBA水平降低，以及小鼠粪便中4HBA、4IA和I3A水平降低。我们还观察到多种共生菌具有在培养物中生产ArAs的能力。值得注意的是，几种肠球菌能够生产AhR激动剂I3A，其水平与已知生产者罗伊氏乳杆菌相当甚至更高，同时还能生产其他ArAs。
先前研究表明，I3A通过上调紧密连接蛋白的表达和促进肠道稳态，对肠道屏障功能具有有益作用。此外，在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型中，I3A和4HBA均能改善结肠炎。本研究显示，肠道微生物显著参与了这些ArAs的生产，并且IBD患者（特别是CD患者）粪便中这两种ArAs的水平低于无IBD的对照组，这表明调节肠道微生物组以增加这些代谢物的产量可能是缓解这些疾病相关症状的一种策略。
CD患者（而非UC患者）的I3A和4HBA水平较低也表明，ArA的消耗可能不仅仅归因于IBD患者胃肠道的炎症环境，而是与CD发病机制的特定方面有关。I3A和4HBA水平之间的强相关性表明，这两种ArAs可能共享共同的代谢途径和/或生产微生物，这与我们的体外数据一致，即许多共生菌能同时生产这两种ArAs。
肠道失去稳态或失调已在包括IBD在内的不同肠道疾病中被描述。本研究中，与无IBD对照组相比，IBD患者中几种共生菌的减少也是其特征。
目前，内窥镜检查是评估IBD严重程度和疾病亚型的最佳方法。然而，其成本、不便、风险和可及性使其不太适合快速和频繁使用。当前临床实践中最广泛使用的生物标志物包括血清和粪便检测中的C反应蛋白和粪便钙卫蛋白，其次是乳铁蛋白。鉴于越来越多的证据支持疾病进展与肠道微生物之间的关系，拥有能够反映肠道微生物群落输出的生物标志物，对于建立可靠的特征分子以反映IBD背景下微生物组成和功能的变化至关重要。此外，通过此类测试区分CD和UC的能力对于IBD的临床管理将具有重大实用价值。用于量化肠道微生物代谢物的稳健、快速和可靠的定量分析方法对于分析大型临床队列和识别这些生物标志物至关重要。
本研究存在一些局限性。在我们的方法中，我们使用了单一内标（IS）。虽然我们观察到使用D6-BA与D4-HBA作为IS在不同样本类型和浓度范围内测量的浓度具有高度相关性，但仍需要化合物特异性IS进行额外的验证。此外，这是一项观察性研究，存在一些未知的混杂因素未得到充分调整，特别是缺乏饮食记录和蛋白质摄入量，这些因素可能直接影响ArA生产的底物可用性。另外，这是一个相对较小的队列，需要在独立和验证队列中进行额外的ArA分析。
