《Gut Microbes》：Simulated microgravity induces cerebral dysfunction by disturbing protective microbiota-metabolite-microglia signaling across the gut?brain axis
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本篇研究通过大鼠模拟微重力模型，揭示了长期微重力暴露通过扰乱肠-脑轴通讯诱发认知障碍的新机制。研究发现，微重力导致肠道菌群失调，以变形菌门（Proteobacteria）增殖为特征，并加速消耗具有神经保护作用的代谢物亚油酸（LA），进而打破中枢神经系统内LA依赖的免疫稳态。LA的缺失促进海马区小胶质细胞的STAT1信号通路活化，驱动神经炎症并损害突触可塑性，最终导致焦虑样行为和认知缺陷。研究提出，膳食补充LA可通过抑制STAT1磷酸化，重塑小胶质细胞表型并改善脑功能，为航天员在轨脑健康防护提供了全新的潜在干预策略。
模拟微重力通过扰乱保护性菌群-代谢物-小胶质细胞信号跨肠-脑轴诱发脑功能障碍
引言
长期载人航天飞行中，微重力环境对宇航员健康构成重大挑战，尤其在任务后恢复期常出现操作能力下降等脑功能问题，其具体机制尚未阐明。肠-脑轴在调控中枢神经系统功能中扮演关键角色。宇航员的胃肠道问题是航天飞行期间第三常见的医疗事件，而真实航天及地面模拟微重力研究均揭示了人类和啮齿类动物存在肠道菌群失调和宿主代谢改变。因此，研究者推测，微重力引起的肠道菌群及其代谢物紊乱，可能通过长期调控小胶质细胞激活，影响宇航员脑功能。本研究旨在探索微重力如何通过微生物群-代谢物-小胶质细胞信号轴导致脑功能障碍。
长期SMG通过破坏突触可塑性诱发脑功能障碍
研究团队利用后肢卸载法建立为期28天的大鼠模拟微重力模型，并设置水平尾部悬吊作为正常重力对照组。行为学测试结果显示，SMG组大鼠在旷场实验中的总运动距离、中心区运动距离均显著减少，在中心区停留时间百分比降低；在高架十字迷宫实验中，开放臂停留时间百分比及开放臂运动距离也显著减少；在Y迷宫测试中，新异臂停留时间百分比及总距离、新异臂距离均下降。这些结果表明SMG能诱发大鼠出现焦虑样行为和空间工作记忆障碍等脑功能障碍表型。
为探究机制，研究人员检测了海马区的病理变化。qRT-PCR结果显示，SMG组海马促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和CCL3的转录水平显著上调，表明SMG激活了海马神经炎症。免疫印迹分析显示，SMG组海马突触后致密蛋白93和95的表达受到抑制。透射电镜观察进一步证实，SMG严重损害了海马区突触超微结构，表现为突触密度和突触后膜厚度显著降低。此外，通过侧脑室注射氯膦酸盐脂质体清除小胶质细胞，显著改善了SMG诱导的运动活动减少和探索行为缺陷，表明炎症性小胶质细胞参与了SMG诱导的病理过程。综上，SMG通过促进海马神经炎症和损害神经可塑性诱发脑功能障碍，且这些病理效应在重力状态恢复至正常后依然持续。
长期SMG损害肠道屏障并影响菌群多样性
SMG预处理后，大鼠结肠组织出现轻度结肠炎特征，包括中度黏膜炎性细胞浸润、杯状细胞数量显著减少、黏膜下层增宽和隐窝深度缩短。结肠组织中促炎因子转录水平显著升高。免疫荧光分析显示，维持肠道上皮屏障完整性的关键紧密连接蛋白ZO-1和OCCLUDIN的表达在SMG组显著降低，证实肠道屏障受损。
对肠道微生物进行16S rRNA测序分析发现，与NG组相比，SMG组物种丰富度和均匀度下降。α多样性分析显示ACE和Chao1指数降低，β多样性主坐标分析也显示两组间微生物群落存在明显分离。在门水平上，SMG消耗了有益共生菌（厚壁菌门和拟杆菌门），并富集了促炎类群（脱硫杆菌门和变形菌门）。LEfSe分析正式将变形菌门确定为SMG处理后富集的特征性菌门。这些发现表明，长期SMG可导致以屏障破坏为特征的肠道功能障碍和以促炎变形菌扩张为特征的肠道菌群失调，且这种不利状态在“着陆后”无法快速恢复。
粪菌移植在NG条件下重现SMG的行为与认知表型
为确认肠道菌群在微重力诱导脑功能障碍中的作用，研究将来自SMG预处理大鼠的粪便通过为期14天的粪菌移植方案移植给NG条件下的受体大鼠。结果显示，FMT-SMG组大鼠在旷场、高架十字迷宫和Y迷宫测试中表现出与原始SMG模型高度一致的行为异常，包括焦虑样行为和轻度认知障碍。qRT-PCR分析显示，FMT-SMG组大鼠海马区促炎细胞因子转录水平显著上调。免疫印迹分析进一步揭示，与FMT-NG组相比，FMT-SMG组海马PSD93和PSD95蛋白表达降低，表明SMG相关的肠道菌群失调加剧神经炎症，损害海马突触可塑性。此外，血常规检测显示FMT-SMG组中性粒细胞百分比显著增加，提示全身性炎症反应被激活。
对受体大鼠肠道菌群的16S rRNA测序分析表明，FMT-SMG组微生物群组成与原始SMG模型相似，变形菌门富集。KEGG通路分析显示，FMT-SMG组的优势细菌显著富集于脂质代谢、核苷酸代谢等通路。同时，FMT-SMG处理加剧了局部肠道炎症，并导致紧密连接蛋白表达显著降低，加重了黏膜屏障损伤。这些发现证实，肠道菌群失调可能是长期SMG诱导脑功能障碍发病机制的关键介质。
促炎性变形菌在SMG条件下加速消耗保护性亚油酸
为了解SMG诱导的神经炎症是否与代谢失调有关，研究对NG和SMG大鼠的粪便样本进行了非靶向液相色谱-串联质谱代谢组学分析。正交偏最小二乘判别分析和主坐标分析均证实SMG诱导了特定的代谢表型改变。差异代谢物分析发现，SMG组中有241种代谢物上调，439种下调。KEGG通路分析显示，脂质代谢通路显著富集，其中亚油酸代谢和类固醇激素生物合成是主要改变的途径。
靶向分析发现，SMG处理后，四种LA下游衍生物13(S)-HpODE、9, 10-DiHOME、9, 10, 13-TriHOME和9, 12, 13-TriHOME的水平显著降低。这些衍生物均属于TriHOME化学家族。海马组织的绝对定量代谢组学分析也证实，SMG暴露降低了LA及其衍生物水平，提示肠道菌群来源的LA及其衍生物可能通过肠-脑轴调节中枢代谢稳态，其下调可能促发SMG诱导的认知障碍和神经炎症。
斯皮尔曼相关性分析显示，LA衍生物与促炎菌属Massilia和铜绿假单胞菌呈负相关。体外共培养实验进一步表明，与大肠杆菌相比，铜绿假单胞菌在对数生长期对LA的摄取更快，在稳定期消耗的LA也显著更多。这些结果表明，在SMG改变的肠道微环境中，铜绿假单胞菌等致病性变形菌的过度增长与LA衍生物的消耗模式异常同步。
口服补充LA通过增强海马突触可塑性改善SMG诱导的脑功能障碍
鉴于肠道促炎菌对LA的消耗与SMG诱导的脑损伤同时发生，研究通过给大鼠饲喂含10% LA的特殊饲料进行了为期两个月的口服LA补充干预。LC-MS证实，补充LA组大鼠海马中LA水平显著高于对照组，表明外源性LA可以穿过血脑屏障并在中枢神经系统积累。
行为测试显示，LA补充部分逆转了SMG诱导的行为缺陷。LA补充组大鼠在旷场实验中心区的探索活动、高架十字迷宫开放臂的运动距离均有所增加，Y迷宫新异臂探索活动也有增加趋势。同时，在FMT-SMG模型中，补充LA同样改善了行为学表型，并降低了结肠和海马中炎症相关因子的转录水平，恢复了海马区下调的突触可塑性蛋白PSD93和PSD95的表达，并抑制了升高的STAT1及其磷酸化水平。
转录组PCR阵列分析显示，LA补充下调了海马中19种炎症细胞因子和受体基因的表达，表明其抗炎作用。血常规检测也显示LA补充降低了SMG诱导的中性粒细胞百分比升高，缓解了全身性炎症。qRT-PCR和免疫印迹分析证实，LA补充促进了海马中多种神经营养因子、CaMK家族、AMPA受体及皮层发育因子的表达。高尔基染色直接显示，LA补充恢复了海马各亚区神经元的树突长度和树突棘密度。透射电镜观察还发现，LA补充显著改善了SMG导致的肠道上皮结构损伤。这些数据表明，膳食补充LA可恢复被变形菌消耗的保护性代谢物，减轻神经炎症，并伴随突触完整性和脑功能的改善。
LA给药增强SMG大鼠模型海马CA1锥体神经元的兴奋性
为进一步探究LA如何改善SMG后大鼠脑功能，研究人员应用全细胞膜片钳技术评估了海马CA1锥体神经元的电活动。结果显示，与NG组相比，SMG组静息膜电位绝对值减小，产生动作电位所需的最小电流（基强度）增加，表明SMG损伤了海马CA1锥体神经元的兴奋性。在相同注入电流下，SMG组诱导的动作电位数量少于NG组。LA口服给药挽救了SMG诱导的大鼠海马神经元兴奋性降低。微型兴奋性突触后电流记录显示，SMG组mEPSC的频率显著降低，而振幅未变，提示自发性条件下突触前信号减少。LA给药部分提高了mEPSC的频率，但未触发振幅变化。综上，SMG影响了大鼠海马CA1锥体神经元的功能，而LA给药可部分恢复SMG相关的神经元兴奋性减弱。
LA通过结合并抑制STAT1在Tyr 701和Ser 727位点的磷酸化来抑制炎症性小胶质细胞激活
为阐明LA发挥神经保护作用的机制，研究使用重力控制器在体外产生了10-3G的模拟微重力环境。细胞活性筛选表明，0-100 μM浓度的LA适用于小胶质细胞系BV2的功能研究。RNA测序分析显示，LA给药显著下调了疾病相关小胶质细胞标记物、多种促炎指标的表达，同时增强了抗炎基因的表达，表明LA重塑了小胶质细胞的极化模式以减轻神经炎症。KEGG通路富集分析揭示了与死亡或存活相关通路的变化。
免疫荧光实验证实，SMG诱导的CD68表达增强可被LA补充显著逆转。同时，LA干预显著减弱了有害的活性氧产生。鉴于STAT1及其磷酸化形式是神经炎症促炎反应的关键调节因子，研究人员检测了总STAT1和磷酸化STAT1的蛋白水平。免疫印迹分析显示，LA给药显著降低了SMG条件下海马组织中t-STAT1和p-STAT1 (Tyr 701)的表达水平。同样，LA补充也逆转了SMG处理的BV2细胞中t-STAT1、p-STAT1 (Tyr 701)和p-STAT1 (Ser 727)表达的增加。使用STAT1抑制剂氟达拉滨的实验表明，LA的抗炎作用与STAT1通路抑制有关，且两者联合使用未显示出协同效应。
分子对接分析揭示了LA与STAT1的结合模式，显示LA与STAT1上的精氨酸残基（Arg 321）之间形成了氢键。表面等离子体共振实验进一步表征了相互作用动力学，证实了LA与STAT1之间存在剂量依赖性的特异性分子相互作用。这些结果表明，LA通过直接结合STAT1并抑制其磷酸化，减轻了SMG诱导的炎症性小胶质细胞激活和氧化损伤。
讨论与结论
本研究通过FMT实验证实了肠道菌群失调在SMG相关脑病中的作用，并揭示了变形菌过度消耗保护性代谢物LA，从而破坏中枢神经系统LA依赖的免疫稳态的机制。即使重力恢复正常，这种消耗也会诱发脑功能障碍。口服LA能限制STAT1介导的小胶质细胞激活，挽救海马突触可塑性损伤，促进从SMG向NG重力转换过程中脑功能的恢复。
研究指出，变形菌门的过度增长与多种神经系统疾病相关，并能破坏肠道屏障完整性，促进有害代谢物易位。在微重力环境下，变形菌的富集消耗了具有神经保护作用的LA及其衍生物。LA及其衍生物能穿透血脑屏障，通过改善神经元功能、重塑小胶质细胞稳态发挥神经保护作用。本研究发现LA通过直接结合并抑制STAT1磷酸化，将SMG激活的小胶质细胞推向静止状态。此外，LA还能改善黏膜屏障功能。NASA双胞胎研究也观察到宇航员外周血免疫细胞中STAT1表达显著增加，这与本研究在SMG小胶质细胞中的发现高度一致。
本研究阐明了肠-脑轴在微重力诱导脑功能障碍中的作用。同时，微重力也可能通过诱发外周免疫系统功能障碍、系统性炎症水平升高以及氧化应激等机制独立或协同地调节中枢神经系统功能。LA可能通过改善外周免疫细胞功能和增强机体抗氧化能力来协同增强这些保护作用，这一潜在机制有待后续实验验证。
总之，本研究揭示SMG通过促进肠道促炎变形菌增殖，加速LA消耗，破坏肠道屏障完整性。这削弱了LA介导的对小胶质细胞STAT1磷酸化的抑制，从而驱动其促炎极化并加剧神经炎症。SMG诱导的LA消耗可能与微重力相关的脑功能障碍密切相关。在SMG条件下膳食补充LA可通过重建海马免疫稳态和减轻突触损伤来改善脑功能。这些发现表明，“微生物群-代谢物-小胶质细胞”轴可能是保护微重力条件下脑健康的潜在靶点。值得注意的是，LA补充作为航天应用的潜在对策，仍需在剂量优化、综合安全性评估及多模型验证等方面进行深入研究，以推动其向临床应用的转化开发。
