《Gut Microbes》：Alcohol consumption in metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD): understanding the gut–liver crosstalk for clinical translation
引言
脂肪性肝病（SLD）是全球最流行的肝脏疾病之一，影响着超过25%的全球人口，构成了重大的公共卫生负担。SLD作为一个总括性术语，涵盖了多种病因导致的肝脏脂肪变性，包括代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD，原名非酒精性脂肪性肝病NAFLD）以及酒精相关肝病（ALD）。代谢综合征（MS）和酒精是SLD的主要原因，且这两种状况在同一个人身上的高流行率使得MASLD和ALD的重叠十分普遍。为此，新术语“代谢和酒精相关肝病”（MetALD）被提出，用于界定那些患有MASLD且酒精摄入量升高（女性140–350克/周，男性210?420克/周）的患者群体。酒精消耗与代谢综合征的有害关联会协同增加肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的发生风险，但其多因素的发病机制尚不明确。
近年来的证据表明，SLD是一种系统性疾病，涉及白色脂肪组织（WAT）功能障碍、肝脏及全身性胰岛素抵抗（IR）、血脂异常、少肌症和心血管疾病。酒精和脂质均在胃肠道被消化吸收，之后通过门静脉循环到达肝脏，这种紧密的解剖和功能联系构成了“肠道-肝脏轴”。过量的酒精和高脂高胆固醇饮食（HFHC）可在多个层面协同破坏肠道-肝脏轴，导致胃肠道炎症、菌群失调、肠道损伤和通透性增加，从而增加了肝脏对微生物产物的暴露并创造了促炎环境。识别在SLD中受影响最严重的肠道-肝脏轴关键组分，为治疗干预提供了可能。
方法
本研究使用了先前建立的临床前小鼠DUAL模型，该模型密切模拟了酒精与HFHC西式饮食（WD）的复合“双重”效应。动物被喂养DUAL饮食（西式饮食D16022301和含10%酒精的甜味饮用水）10周（短期）或23周（长期），并与仅喂食WD及甜味饮用水组和正常饮食对照组进行比较。在实验终点，通过组织化学、流式细胞术、基因表达、蛋白质组学和代谢组学分析评估肝脏和肠道表型。此外，还在DUAL小鼠和具有饮酒史的MASLD患者中研究了该饮食对肠道微生物群的影响。在小鼠中进行了抗生素诱导的微生物群耗竭（AIMD）和微生物群调节疗法（益生菌和粪菌移植FMT）。使用原代人肝细胞（PHH）和HepG2细胞研究潜在机制，并将暴露于酒精和HFHC饮食的斑马鱼幼虫用作验证模型。
结果
增强的肠道脂肪吸收和改变的肝脏脂肪代谢
DUAL饮食（WD联合酒精）喂养23周后，小鼠肝脏显著增大并出现脂肪变性。代谢组学和脂质组学分析显示，DUAL小鼠粪便脂肪排泄率低，表明膳食脂质在肠道的吸收率更高。具体表现为，DUAL小鼠十二指肠、空肠和回肠的自由脂肪酸（FFA）吸收率增加，小肠各段中促进FFA摄取的膜蛋白Cd36表达上调。相比之下，仅喂食WD的小鼠FFA吸收和回肠Cd36表达较低，粪便非酯化脂肪酸（NEFA）水平显著高于DUAL组，这提示WD和酒精对脂质吸收具有强烈的正向协同效应。
肝脏的RNA测序和蛋白质组学分析揭示了DUAL动物肝脏脂质代谢相关因子的深刻改变。与仅喂食WD的小鼠相比，DUAL动物肝脏中Cd36的mRNA和蛋白水平均显著上调，表明FFA向肝脏的流入是由WD和酒精的协同作用触发的。此外，肝脏新生脂肪生成的关键调节因子硬脂酰辅酶A去饱和酶1（SCD-1）的表达增加，导致单不饱和脂肪酸（MUFA）、甘油二酯（DG）和甘油三酯（TG）水平升高。尽管有大量的膳食FFA涌入、增强的新生脂肪生成，但肝脏脂质β-氧化、肉毒碱棕榈酰转移酶1a（CPT-1a）以及脂质分解代谢的几个关键调节因子（如Ppara、Hadh和Acadl）并未相应增加，从而促进了肝脏脂肪变性的进展。
血清TG水平并未成比例增加，甚至低于对照动物，提示极低密度脂蛋白（VLDL）的肝脏分泌受损。代谢组学研究显示，富含多不饱和脂肪酸（PUFA，如22:6, 20:4）的磷脂酰胆碱（PC）分子减少，而这些是VLDL颗粒形成所必需的。与磷脂酰乙醇胺N-甲基转移酶（PEMT）活性和VLDL组装相关的PC(22:6)/PC和PC(20:4)/PE(20:4)比率在DUAL小鼠中也降低，RNA测序也证实了DUAL小鼠中脂质输出相关通路的下调。
DUAL饮食诱导的肝炎：脂毒性物质与Toll样受体激活的复杂相互作用
肝脏中大量脂质沉积、脂毒性DG和游离胆固醇（FC）的显著改变以及摄入的酒精共同导致了氧化应激、肝损伤和炎症。DUAL肝脏的流式细胞分析显示，单核细胞来源的巨噬细胞（MoMFs）、总T淋巴细胞（CD3+）和细胞毒性T淋巴细胞（CD8+）显著增加，自然杀伤（NK）细胞增加，而辅助性T细胞（CD4+）减少。RNA测序证实了先天免疫反应的激活以及与Toll样受体（TLR）信号和NF-κB活化相关的基因集/通路的富集。肝脏蛋白质组学分析显示，TLR及其下游炎症信号节点（如MyD88、NF-κB和IRAK4）显著上调。
qPCR分析进一步验证了Tlr2、Tlr4和Tlr9表达的增加。与仅喂食WD的小鼠相比，DUAL组肝脏Tlr4表达显著更高，表明酒精和WD的组合相互加强了TLR的激活。TLR可由进入血液循环的细菌、病毒或真菌副产物激活。其中研究最广泛的TLR触发因子之一是革兰氏阴性菌产生的细菌表面脂多糖（LPS），通常发生在肠道屏障泄漏的情况下。与之一致的是，DUAL小鼠血清LPS水平升高。
DUAL饮食引起肠道形态学的显著改变
DUAL喂养导致小鼠整体肠道长度显著缩短，主要是由于结肠缩短。组织学分析显示隐窝深度大幅减少。肠道长度缩短和绒毛/隐窝萎缩是肠道损伤的生物标志物。相应地，在DUAL喂养动物的结肠隐窝中观察到的显著的肠上皮细胞（IEC）死亡，并未被增殖充分补偿。值得注意的是，酒精与WD结合显著增加了肠道形态学改变的数量。相比之下，仅喂食WD的小鼠未显示显著的结肠缩短，隐窝萎缩较轻微，并且潜在的结肠细胞损伤可通过增加的增殖得到补偿。
在DUAL小鼠的结肠中发现了多个肠道相关淋巴组织（GALT）结构，主要由T淋巴细胞和B淋巴细胞组成，巨噬细胞和单核细胞较少。流式细胞分析明确识别出T和B淋巴细胞群体增加，但辅助性T细胞无差异，而细胞毒性CD3+/CD8+细胞显著增加。此外，DUAL喂养导致γδ-T细胞减少（这与严重的肠道炎症有关），以及调节性T细胞（T-reg）增加。结肠中促炎细胞因子Tnf-α的表达也显著上调。在仅喂食WD的小鼠组中，B淋巴细胞群体增加了2.5倍，而T淋巴细胞，特别是细胞毒性CD8+/CD3+细胞未受影响，γδ-T细胞保持不变，T-reg细胞显著增加，这表明WD喂养动物的肠道炎症反应较DUAL动物温和。
DUAL饮食削弱肠道屏障并增加肠道通透性
与先前报道一致，WD通过影响粘液产生和紧密连接（TJs）表达对肠道屏障产生负面影响，从而导致肠道通透性增加。在DUAL喂养下，结肠中粘蛋白-2（MUC2）糖蛋白的免疫荧光染色显示其显著减少。DUAL饮食诱导的结肠粘液层损失和损伤与分泌型免疫球蛋白A（sIgA，屏障免疫稳态的关键调节因子）的显著减少有关。
此外，在DUAL喂养动物的结肠中检测到紧密连接（如闭锁小带蛋白-1（ZO-1）和闭合蛋白（occludin））数量的轻度减少。同时，肠道血管屏障（GVB）的跨膜糖蛋白CD34的表达在结肠中降低。肠道屏障所有层面的改变导致了肠道渗漏性增加。血清中FITC-葡聚糖的显著增加以及DUAL喂养动物粪便中白蛋白浓度的升高，证实了GVB破坏和肠道屏障功能障碍。
DUAL饮食引发肠道微生物群的变化
16S rRNA基因扩增子测序显示，对照小鼠和DUAL小鼠的粪便微生物群组成在属和科水平上存在显著差异。通过计算最近平衡（nearest balance）进行比较分析发现，DUAL动物中增加的微生物类群包括先前与人类高脂肪和高糖消耗相关的类群，如拟杆菌属（Bacteroides）、副拟杆菌属（Parabacteroides）和另枝菌属（Alistipes），以及脱硫弧菌科（Desulfovibrionaceae）内未分类的属。研究还发现DUAL小鼠粪便中的短链脂肪酸（SCFA），特别是戊酸盐减少，这与肠道通透性增加、肠道炎症和肝纤维化有关。尽管样本量较小，平衡分析和排序图显示，仅喂食WD的小鼠的肠道微生物群落与DUAL组不同，这表明在WD中添加酒精会加剧微生物群落的破坏。
接下来，研究人员探索了DUAL小鼠的微生物群变化与患有MASLD且有轻度但规律饮酒史的肥胖患者之间的潜在相似性。对照个体和SLD患者之间粪便微生物群组成的总体差异（属水平PERMANOVA: p = 0.003）通过最近平衡分析进一步研究，发现某些模式与在DUAL小鼠中观察到的相似，包括拟杆菌属（Bacteroides）和另枝菌属（Alistipes）的增加。
抗生素诱导的微生物群耗竭（AIMD）减轻了DUAL喂养动物的肝脏脂肪变性和炎症
为了验证DUAL饮食诱导的肝损伤是否由肠道微生物群介导，研究人员通过口服灌胃给予广谱抗生素混合物进行AIMD。16S rRNA基因扩增子测序显示抗生素处理后微生物类群显著耗竭。
DUAL动物经抗生素治疗后，血清中肠道来源的细菌LPS水平以及随后肝脏中TLR4的表达均显著降低。这些变化对肝脏病理产生了显著影响：减轻了肝肿大，缓解了脂肪变性，并降低了DUAL喂养小鼠肝脏中的TG水平。脂肪变性的缓解并非由于肝脏脂质流入减少，因为抗生素处理后Cd36的表达未改变。然而，AIMD增加了肝脏CPT-1c的表达水平，这表明脂质氧化的上调可能是观察到肝脏脂肪变性减少的潜在机制。
脂肪变性减少减轻了肝损伤、炎症，并减少了DUAL喂养小鼠经抗生素治疗后的肝脏胶原沉积。为进一步验证这些关键数据，研究使用了第二种更生理性的AIMD模型，在DUAL喂养的最后4周向饮用水中补充抗生素混合物。结果一致地显示，DUAL+ABXdw显著降低了肝脏重量，减轻了肝脏脂肪变性，降低了肝脏TG含量，减少了血清肝酶，减轻了炎症，并降低了肝脏中促纤维化胶原蛋白I的表达。
益生菌给药未能改善DUAL诱导的脂肪性肝炎
接下来，研究人员测试了多菌株益生菌作为DUAL小鼠的潜在治疗策略。然而，对DUAL喂养小鼠施用益生菌既未减轻DUAL饮食诱导的肝肿大，也未减轻肝脏脂肪变性。同样，益生菌给药后，通过Cd36表达确定的肝脏脂质摄取以及通过CPT-1c量化的脂质氧化均未改变。因此，益生菌治疗对DUAL处理小鼠的肝损伤和肝脏胶原沉积没有影响。最后，肝脏中Tlr4 mRNA表达在各组间没有差异。
粪菌移植（FMT）在DUAL喂养动物中对脂肪性肝炎产生轻微的治疗效果
研究人员评估了通过口服治疗从健康供体进行FMT对DUAL喂养小鼠的疗效。对DUAL动物进行FMT后，仅观察到肝肿大略有改善，肝脏脂肪变性适度减少（与较低的肝脏TG含量相关）。FMT后，DUAL动物中Cd36的表达保持不变，检测到脂质氧化（以CPT-1c水平指示）有不显著的增加。因此，肝脏脂肪变性的轻度减轻与FMT后DUAL喂养小鼠的肝损伤和纤维化适度减少相关。
尽管肝脏表型的积极变化是适度的，并且DUAL+FMT组的大多数参数未达到对照水平，但结肠的肠道通透性和屏障完整性显示出轻微改善。然而，FMT后DUAL动物肝脏中Tlr-4的表达和血清LPS水平保持不变。
在DUAL+FMT小鼠的肠道微生物群组成中未观察到单向动态变化。然而，观察到三种共生细菌物种显著增加：啮齿类粪杆菌（Faecalibacterium rodentium）、纽约杜博氏菌（Dubosiella newyorkensis）和嗜粘蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）。这些物种，以及在DUAL+FMT小鼠中也有所增加（尽管相对丰度较低）的韦氏迪索菌（Dysosmobacter welbionis），被认为对宿主代谢具有有益影响。
LPS在体外对肝脏脂质代谢有直接影响
为了进一步验证关键发现，研究人员在HepG2人肝癌细胞中应用了体外DUAL模型。结果支持体内发现，并清楚地表明“双重”处理（棕榈酸PA + 酒精）协同增加了HepG2细胞中的脂质积累。在DUAL小鼠模型中，血清中LPS的存在与由于CPT-1c介导的脂质氧化不足导致的肝脏脂肪积累有关。一致地，用PA加酒精和最高浓度LPS处理的HepG2细胞呈现最高水平的脂质积累，这与CPT-1a介导的脂质氧化减少直接相关。为了进一步证实这一重要发现，研究人员在原代人肝细胞（PHH）中测试了体外DUAL处理（棕榈酸PA加酒精）与LPS联合应用的后果。正如预期，PHHs的体外DUAL处理导致细胞内脂质积累，在LPS应用后以剂量依赖性方式大大增强。值得注意的是，DUAL+LPS诱导的PHH脂质积累与CPT-1a蛋白表达的损伤有关。
酒精与HFHC联合暴露在斑马鱼幼虫中诱导肝脂肪变性和肠道损伤
最后，为了验证和比较DUAL小鼠模型的临床可转化性，研究使用了第二种模式生物——斑马鱼幼虫。在小鼠中观察到的表型在受精后9天的斑马鱼幼虫中得到了有效复制，暴露于酒精和高脂高胆固醇（EtOH/HFHC）蛋黄饮食导致肝脏脂质积累增加。斑马鱼肝脏的阿利新蓝/PAS染色组织病理学分析显示，暴露于酒精和HFHC饮食的肝细胞出现变形、气球样变和脂肪积累，类似于哺乳动物中发生的肝实质破坏。一致地，同时暴露于酒精和HFHC饮食的斑马鱼幼虫肠道的阿利新蓝/PAS染色显示组织结构松弛、隐窝变平和绒毛萎缩，这被认为是IEC增殖与死亡失衡的结果。
讨论
“肠道-肝脏轴”指的是肠道、微生物群和肝脏之间相互的功能相互作用。由于肠道和肝脏是相互依赖的器官，肠道屏障的改变可能导致细菌或其产物通过门静脉流入肝脏增加，从而引发各种肝脏疾病，包括MASLD和ALD。MASLD与同时饮酒的组合指的是一种独特的系统性且潜在多轴的疾病实体，其发病机制仍不清楚。在本研究中，我们利用临床前小鼠DUAL模型研究了微生物群-肠道-肝脏串扰的相关性，并探索了潜在的 therapeutic circuits。
DUAL喂养诱导了显著的肠道形态学改变，并增加了未被代偿性增殖平衡的IEC死亡。这导致绒毛萎缩、上皮细胞间隙形成和通透性改变，加剧了上皮脱落和炎症反应。在DUAL结肠中发现的多个GALT结构以T细胞和B细胞群体扩增以及促炎细胞因子水平升高为特征，这已被报道为局部免疫反应的主要诱导因素。此外，DUAL喂养导致细胞毒性T细胞显著增加和保护性γδ-T细胞减少（先前在临床前研究中与严重肠道炎症相关）。相应的低水平sIgA恶化了肠上皮对病原微生物的保护，并进一步破坏了微生物群稳态。DUAL小鼠的肠道损伤和炎症导致粘液层和紧密连接的显著破坏，结合GVB完整性的丧失，增加了双向肠道通透性。
粪便样本的16S rRNA扩增子测序揭示了DUAL小鼠的微生物群失调以及优势细菌科和单个物种组成的重要变化。肠道菌群失调是包括MASLD和ALD在内的多种疾病的标志，强调了其在维持肠道健康和恢复力中的重要性。更具体地说，在DUAL动物中发现了拟杆菌属（Bacteroides）的显著增加，这与富含脂肪和糖的粪便内容物相关，并且已知与MASLD发病机制呈正相关。这伴随着普雷沃菌属（Prevotella）的减少，这与这两个属之间的竞争关系一致。由于普雷沃菌合成SCFA，特别是戊酸盐，它们的耗竭可能与在DUAL小鼠中观察到的SCFA减少有关。这可能加剧了肠道屏障完整性、粘液产生和抗炎保护的丧失。重要的是，DUAL饮食后细菌组成的一些变化类似于SLD患者的菌群失调模式，支持了我们模型的相关性。
饮食诱导的微生物群改变，连同高通透性的肠道屏障，促进了LPS进入肝脏的门静脉流入，在肝脏中它（i）通过激活TLR相应的下游炎症信号节点触发促炎级联反应；以及（ii）通过抑制β-氧化促进肝脏脂肪变性。
事实上，DUAL动物表现出增强的肠道脂肪吸收能力。因此，在DUAL喂养23周后，我们观察到FFA大量涌入肝脏，同时伴有增强的新生脂肪生成以及脂质输出和β-氧化受损，所有这些共同导致了进行性脂肪变性。我们的体内和体外发现证实并扩展了先前的研究，证明了LPS对FFA氧化，特别是其关键调节因子CPT1的抑制作用。肝细胞中LPS相关的β-氧化减少可能是系统协调宿主反应增加FFA和TG以提供对宿主防御或组织修复起关键作用的细胞所需脂质底物的副产品。
然而，DUAL肝细胞无法通过充分的β-氧化降解FFA，导致了肝脏脂肪变性，引发氧化应激、细胞死亡和免疫细胞浸润到肝组织。在DUAL喂养小鼠的肝组织中，我们观察到NK细胞、MoMFs、细胞毒性T淋巴细胞增加，以及辅助性T细胞减少，所有这些共同促进了肝脏炎症、损伤和纤维化。
事实上，肝脏的先天免疫反应在SLD的发病机制中至关重要。肝脏中的免疫细胞识别细胞损伤或病原体入侵，随后启动信号级联反应并进一步促进炎症反应，导致未解决的慢性炎症状态。T细胞群失调，CD3/CD8+T淋巴细胞增加和CD4+T细胞减少，模拟了人类脂肪性肝炎的发病机制，并与疾病向更晚期纤维化的进展相关。
重要的是，通过AIMD耗竭细菌显著降低了血清LPS水平，通过增加CPT-1c介导的脂质氧化改善了脂质积累，阻断了TLR4炎症级联反应，从而阻止了肝纤维化的进展。
我们的研究结果表明，针对DUAL动物中失衡的微生物群在很大程度上可以预防SLD的发展。然而，必须认识到细菌与宿主共生相互作用，包括调节代谢、维持免疫稳态和保持健康的肠道屏障。
微生物群调节是SLD的一种新型治疗策略。虽然营养和生活方式干预仍然是ALD和MASLD的主要建议，但坚持饮食改变通常具有挑战性。因此，在本研究中，我们在保持DUAL小鼠饮食的同时改变了它们的微生物群。最初，我们探索了益生菌补充的治疗潜力，先前有研究表明其可减轻肝脏脂肪变性和炎症。然而，我们的发现并未证明显著的临床益处。我们推测，益生菌中的某些有益细菌可能难以在DUAL肠道中有效定植，这可能是由于共生细菌水平降低所致。
认识到益生菌补充的局限性，我们提出了一种替代方法：来自健康供体的FMT。动物研究和临床试验已显示FMT在改善肝脏健康、肠道通透性和代谢综合征方面具有前景。我们的研究揭示了FMT后DUAL小鼠肝脏损伤标志物的部分改善以及肠道表型的增强。16S rRNA基因扩增子测序显示，FMT在物种水平上诱导了组成变化的趋势；需要更大的样本量来评估区分这些动物与DUAL动物和对照动物的具体变化方向。注意到一些共生细菌物种的增加，如啮齿类粪杆菌、纽约杜博氏菌和韦氏迪索菌，这些物种已被发现具有肝保护特性和对宿主代谢的有益影响。此外，我们观察到了其他细菌类群的变化，如嗜粘蛋白阿克曼菌，已知其在维持粘膜屏障完整性和整体肠道稳态中发挥作用。我们的结果支持FMT作为SLD治疗干预的潜力，尽管其疗效需要进一步研究。
我们研究中的几个重要发现代表了该领域先前工作的主要新颖性。首先，从现有文献可知，啮齿类动物并非研究酒精消耗的最易转化模型，因为它们代谢酒精快，且与人类相比基础代谢率高。斑马鱼幼虫和小鼠在肠道和肝脏关键改变方面的相似性不仅支持了我们的发现，而且为利用高效、快速且成本效益高的模型探索SLD病理生理学的更广泛方面铺平了道路。
其次，酒精消耗与代谢风险因素的同时组合不应被视为单纯的ALD或MASLD。与先前的观察一致，我们的研究为高脂肪食物和酒精摄入之间的相互作用提供了一些见解，表明每种营养素可能刺激另一种的摄入。在DUAL小鼠中，酒精刺激了WD摄入的增加，反之亦然。这一点很重要，因为DUAL模型中这种恶性的协同作用导致了与单独WD相比显著的热量过剩。然而，正如补充图18A所总结，DUAL和WD之间观察到的差异并不仅仅归因于热量摄入增加。此外，DUAL小鼠的膳食脂质肠道吸收率相对较高，导致FFA大量涌入肝脏。体内和体外数据证实，肝细胞无法通过充分的β-氧化降解脂质以应对“双重”损伤（酒精联合高脂肪），这进一步加剧了肝脏脂肪变性。此外，在肠道中，酒精和WD的组合对IEC增殖有更严重的负面影响，导致更显著的肠道损伤、炎症和更明显的微生物群失衡，这些共同过度激活了肝脏中的TLR4炎症级联反应，并加强了肝脏炎症/纤维化的进展。
事实上，MASLD与酒精摄入之间的联系近年来一直是争论的话题。我们的研究结果强调，除了减轻代谢负担外，鼓励戒酒对MASLD和MetALD患者是一种有益且值得推荐的治疗方法。我们建议与酒精相关的公共卫生指南应纳入更多解决酒精、肥胖和SLD之间联系的公共卫生倡议。
总之，利用小鼠DUAL模型、斑马鱼幼虫、细胞系和患者队列提供的证据表明，肠道-肝脏轴破坏在由酒精和并存的代谢风险因素诱导的SLD发病机制中起着关键作用。肠道菌群失调是这种功能障碍发展的决定因素，因此，基于肠道的早期治疗干预可能有益于阻止MetALD的发展。
