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本研究通过转录组学、代谢组学与体外功能实验，系统比较了与坏死性小肠结肠炎（NEC）相关的产丁酸梭菌（Clostridium butyricum）临床株CB1002及其同源hbd基因缺失突变株。研究发现hbd缺失导致670个基因差异表达，涉及细菌代谢、趋化、群体感应、细胞壁合成与氧化应激等潜在毒力机制，并通过转录重编程影响细菌毒力，为理解C. butyricum在NEC发病中的作用提供了新的遗传学视角。
文章内容归纳总结
转录组、代谢组、以及炎症和氧化特性：产丁酸梭菌CB1002临床株及其同源突变株Δhbd的比较研究
摘要
产丁酸梭菌（Clostridium butyricum）CB1002是一株与致死性坏死性小肠结肠炎（NEC）病例相关的临床菌株。先前研究表明，其hbd基因（编码β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶）经基因失活后，在NEC动物模型中失去了肠致病性。本研究旨在从多组学层面和细胞功能层面，深入探究这一表型变化背后的分子机制。研究团队对CB1002野生型（WT）及其同源突变株CB1002 Δhbd（HBD）进行了系统的比较分析。
研究首先对处于指数生长中期的细菌培养物进行了RNA测序（RNA-Seq），并对细菌培养上清液进行了非靶向代谢组学分析。结果显示，在CB1002 Δhbd与CB1002 WT之间，共鉴定出670个差异表达基因。其中61个基因与潜在的毒力机制相关，可归类于细菌代谢、细胞壁肽聚糖合成、趋化性与群体感应、鞭毛组装以及氧化应激反应通路。这些发现表明，hbd基因的缺失引发了广泛的转录重编程。
在功能验证方面，研究利用人外周血单个核细胞（PBMC）评估了菌株对细胞因子（IL-10, IL-17, IL-22, IFNγ）分泌的影响，并利用Caco-2细胞系评估了菌株对活性氧（ROS）、超氧阴离子（O2•?）和过氧亚硝酸盐（ONOO–）产生的影响。体外实验发现，与CB1002 WT相比，CB1002 Δhbd的细菌碎片刺激PBMC产生的IL-10水平显著降低。然而，在不同实验条件和菌株处理下，Caco-2细胞产生的ROS、O2•?和ONOO-水平均无显著差异。
综合而言，本研究结果提供了将C. butyricum与NEC联系起来的新遗传学见解，支持了hbd缺失通过影响细菌的转录重编程从而改变其毒力的假说。
引言
坏死性小肠结肠炎是极早产新生儿中最常见的肠道疾病之一，具有高死亡率（可达30%）和严重的长期并发症。其发病机制复杂，微生物菌群失调被认为是关键因素之一。在诸多与NEC相关的细菌中，梭菌属（Clostridium）细菌，特别是产丁酸梭菌，在流行病学研究、临床症状和动物模型中均显示出与NEC发展的关联。
产丁酸梭菌是严格厌氧的革兰阳性芽孢杆菌，广泛存在于环境和人畜肠道中。尽管它是早产儿肠道菌群的组成部分，但其肠道定植与NEC的发生相关。动物模型研究进一步证实，用产丁酸梭菌CB1002临床株定植的动物，其肠道NEC样病变的发生频率和严重程度显著高于用其hbd基因缺失的同源突变株定植的动物。hbd基因编码的β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶，参与了中心碳水化合物发酵途径的初始步骤，负责将丙酮酸转化为丁酸。然而，此前尚未对宿主的炎症和氧化还原细胞反应进行分析。
由于缺乏能够区分产丁酸梭菌无症状携带与致病菌株的特异性表型或分子标记，本研究旨在通过比较CB1002 WT与CB1002 Δhbd的转录组，并评估两菌株的促炎和氧化还原特性，来检验基因表达可能影响毒力的假设。
材料与方法
本研究所用菌株CB1002分离自NEC致死病例的粪便样本。CB1002 Δhbd是通过同源重组使hbd基因失活构建的同源菌株，以阻断丁酸发酵途径。所有培养均在厌氧条件下进行。
对于转录组学分析，在指数生长期收获细菌，提取RNA并构建文库，使用Illumina平台进行测序。数据分析采用Sequana RNA-Seq流程，使用Bowtie2将reads比对至CB1002 WT基因组，并使用DESeq2进行差异表达分析。CB1002 WT基因组经测序、组装和注释，获得约4.57 Mb的基因组大小。差异表达基因（DEGs）进行了基因本体（GO）注释、京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析以及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。
对于功能实验，使用人PBMC通过酶联免疫吸附试验（ELISA）定量细胞因子（IL-10, IL-17, IL-22, IFNγ）。使用人结肠腺癌Caco-2细胞系，通过荧光探针和商业试剂盒分别检测总ROS、O2•?和ONOO–的水平。代谢组学分析则对细菌培养上清液进行液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）分析，并使用气相色谱测定短链脂肪酸（SCFAs）水平。
结果与讨论
de novo转录组组装
RNA-Seq产生了高质量数据集，平均每个样本2400万条reads，其中99%成功比对至CB1002 WT基因组。对CB1002 WT基因组的测序和注释揭示了其大小为4.57 Mb，G+C含量为28.52%，共注释了4198个编码序列。
差异表达基因的鉴定
在注释的基因中，有670个显示显著差异表达，包括328个上调和342个下调基因。KEGG富集分析显示这些基因参与代谢和生物合成途径、ABC转运蛋白、双组分系统、群体感应、趋化和运动等。COG分析则显示大部分匹配基因功能未知，或与复制转录翻译、碳水化合物代谢、能量产生和离子转运相关。
为探究hbd突变导致鹌鹑NEC模型中肠致病性丧失的原因，研究重点关注了CB1002 HBD与WT之间差异表达的潜在毒力基因。最终筛选出61个感兴趣的基因，涉及细菌趋化、鞭毛和菌毛组装、群体感应、代谢、细胞壁合成和氧化应激反应。
细菌趋化、鞭毛和菌毛组装相关差异表达基因
在61个差异表达基因中，有14个属于趋化相关KEGG类别，包括cheY、cheX、cheV、九个mcpB基因、pilT和pilB。在CB1002 HBD中，cheY下调，而cheX和cheV上调。甲基趋化受体蛋白MCPB与CheA/CheY组氨酸激酶双组分信号系统相互作用，控制鞭毛运动以响应驱避剂。cheX和cheV编码偶联蛋白，可调节CheY活性并影响运动性。鞭毛组装基因motA和fliB在CB1002 HBD中也受到抑制，这与先前观察到的该突变株游泳和集群运动能力降低一致。此外，pilB和pilT在突变株中表达也受到抑制。PilB是IV型菌毛组装的ATP酶，PilT为菌毛收缩提供动力，这些发现与早期观察到的CB1002 HBD抽搐运动减少相符。趋化性和运动性与细菌的粘附、生物膜形成、自聚集和宿主相互作用密切相关，这些过程都与毒力有关。
群体感应相关差异表达基因
研究发现，oppA、oppB、oppC和oppD在CB1002 HBD中下调。这些基因形成一个操纵子，编码ATP结合盒转运蛋白的膜相关蛋白。细菌Opp系统参与短肽转运，包括通过RRNPP型群体感应系统进行氨基酸摄取和肽介导的信号传导，从而调节毒力基因表达。此外，argCJBDF操纵子的表达在CB1002 HBD中受到抑制。agrD编码的前体肽被AgrB加工成自诱导肽（AIP），激活传感器激酶AgrC并启动响应调节级联反应以调控基因表达。Agr系统在群体感应中起基础作用，调节毒力因子的时空表达、代谢灵活性和生存。在艰难梭菌（C. difficile）中，agrD及其下游基因agrB和agrC的激活可能参与毒素产生、鞭毛生物合成和环二鸟苷酸信号传导。
代谢相关差异表达基因
研究证实hbd基因在CB1002 HBD中显著抑制，ptb和buk基因也是如此。ptb编码磷酸转丁酰酶，buk编码丁酸激酶，它们是参与丁酸生产的关键酶。几个糖代谢基因也被下调，包括lacZ、cbgA、agaA、ilvC、ilvB和lctP。LacZ、CbgA和AgaA是参与糖分解代谢的糖苷酶。ilvB和ilvC分别编码乙酰羟酸合酶（IlvB）和酮酸还原异构酶（IlvC），参与支链氨基酸（BCAAs）的生物合成。hbd突变体可能转向使用BCAAs作为氧化还原中性溢出或用于生物合成，以应对碳/氮失衡。lctP编码乳酸通透酶，其抑制表明乳酸摄取受限。CB1002 HBD可能下调某些糖利用和生物合成基因，以避免其受损的发酵网络过载并维持能量/氧化还原平衡。毒力相关功能，如半乳糖苷酶活性、乳酸和氨基酸代谢，已被直接或间接地与致病性联系起来。
相反，galR、galTKE、glpKF和ldh-1被上调。由于hbd突变阻断了丁酸途径并损害了NADH氧化，ldh-1的上调可能代表了一种恢复氧化还原平衡的补偿反应。由GalR调节子调控的galTKE操纵子编码负责通过Leloir途径分解半乳糖的酶，这使得葡萄糖-1-磷酸能够进入糖酵解并被氧化为丙酮酸，使细菌能够利用替代能源生存和增殖。这与甘油激酶GlpK和甘油摄取促进因子GlpF的过表达一致，表明代谢可能转向1,3-丙二醇生产。这些数据共同表明，细菌代谢的重新定向影响了其生物学特性和毒力。
细菌细胞壁相关差异表达基因
参与肽聚糖生物合成的基因在CB1002 HBD菌株中显著差异表达。glmU和murA在突变株中受到抑制。这些基因分别编码N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷转移酶和UDP-N-乙酰葡糖胺-1-羧基乙烯转移酶，参与肽聚糖UDP-N-乙酰葡糖胺生物合成的细胞质步骤。编码D-丙氨酸连接酶的ddlB基因在CB1002 HBD菌株中过表达，该酶催化D-丙氨酸掺入细菌细胞壁脂磷壁酸。在产丁酸梭菌中，D-丙氨酰化增加了细胞壁的疏水性。先前研究已报道CB1002 HBD比CB1002 WT具有更高的表面疏水性。编码推定青霉素结合蛋白的penP基因和编码双组分系统VanSR推定细胞质响应调节子的vanR基因，在CB1002 HBD中也差异表达。PenP和VanSR与肽聚糖修饰有关。有趣的是，参与细菌感受态的comEC和comB在突变株中过表达，提示可能存在细胞壁修饰。这些修饰可能通过影响粘附、生物膜形成、应激反应和对阳离子抗菌肽的抵抗力，从而改变细菌毒力。
氧化应激相关差异表达基因
氧化应激相关基因（sodA、nirA_1和ldh）在CB1002 HBD菌株中相比WT菌株显著过表达。sodA编码超氧化物歧化酶，可解毒超氧化物并与过氧化氢酶协同清除ROS。nirA能够在亚硝化应激下实现反硝化作用，ldh则支持氧化还原平衡。无法通过丁酸合成氧化NADH的hbd突变体，可能转向氧化还原补偿模式。这些基因与氧化应激下生存力和毒力的增强有关。相反，trxB和bcp上调，而trxA下调。trxA编码硫氧还蛋白系统的电子载体，为还原蛋白质中的二硫键提供电子。trxB编码硫氧还蛋白还原酶，利用NADPH再生还原型硫氧还蛋白。硫氧还蛋白系统的这种表达模式可能表明细菌正在重新分配NADPH并防御氧化应激。这与bcp（编码一种解毒过氧化物的过氧化还原蛋白）的上调一致，也与sodA的表达一致，表明细菌正在防御超氧化物和过氧化物。gloA编码乙二醛酶I，用于解毒中心碳代谢副产物甲基乙二醛，该基因也过表达。在丁酸生产被阻断的CB1002 HBD突变株中，丙酮酸和上游中间体可能积累。gloA的过表达有助于通过解毒甲基乙二醛来防止碳诱导的细菌活力丧失。这些系统也参与抵抗应激。
蛋白质-蛋白质网络分析
研究分析了61个感兴趣的差异表达基因之间的相互作用。产丁酸梭菌的相互作用网络包含29个节点，揭示了八个簇，包括精氨酸、丁酸、半乳糖代谢、细菌趋化、氨基糖生物合成（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成）、甘油脱氢酶和碳水化合物激酶，以及氧化应激相关蛋白。研究还比较了产丁酸梭菌和新生梭菌（Clostridium neonatale）的PPI网络。新生梭菌是梭菌属严格意义簇I中与产丁酸梭菌亲缘关系最近的物种，并且先前也曾从NEC病例中分离出来。与产丁酸梭菌类似，在新生梭菌250.09临床株中删除hbd基因也消除了其在鹌鹑NEC动物模型中的肠致病性。对新生梭菌PPI网络的分析识别出19个节点，其簇与产丁酸梭菌相似，包括缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、半乳糖和丁酸代谢，以及氧化应激相关蛋白。两个物种之间有33个蛋白质重叠。新生梭菌网络比产丁酸梭菌网络小，表明存在物种特异性差异。然而，共享的蛋白质网络指向了保守的通路，这与它们在鹌鹑NEC模型中相似的肠致病行为相符。
基因表达相关性
分析揭示了在hbd缺失后基因表达发生显著改变的独特基因簇，表明正常代谢受到干扰。galE、galR、galK、galT、agaA、sodA、ldh、bcp、mcpB、fliB、comB、grxC和nirA在CB1002 HBD中的过表达，表明碳通量发生转变、细胞壁组成改变以及替代糖和电子受体利用增加。nirA的上调表明氮代谢（可能涉及硝酸盐）发生调整。这种代谢重编程可能增加有毒副产物的形成，这反映在sodA、bcp、grxC和trxB的共表达上，进而可能触发gloA介导的解毒作用。opp操纵子、arg操纵子、motA、pilT和mcpB的相关表达，指向了针对营养应激的协调反应，增强了营养摄取和环境感知，涉及群体感应。mcpB、fliB和che基因的上调支持了因β-羟基丁酰辅酶A脱氢酶功能丧失而导致的不利条件下，趋化反应的改变。值得注意的是，gloA、nirA和cheV也受到一般应激反应通路的调控。
基因表达与代谢物的相关性
研究证实CB1002 HBD的培养上清液中未检测到丁酸，其产生的乙酸和丙酸盐水平与先前报道的CB1002 WT相似。通过对用于RNA-Seq分析的相同培养上清液进行非靶向代谢组学分析，共鉴定出28种代谢物。与galE、galR、galK、galT、agaA、sodA、ldh、bcp、mcpB、fliB、comB、grxC和nirA的过表达一致，研究在CB1002 HBD中鉴定出与代谢转变相关的代谢物。CB1002 HBD具有更高水平的乳酸、乙偶姻、氧代丁酸和糖类，这些是发酵通量产物，表明存在丙酮酸溢出和向多通路分流。研究还鉴定出吲哚乳酸和苯乳酸，它们分别是色氨酸和苯丙氨酸的衍生物，与厌氧和发酵条件下溢出代谢期间的氨基酸降解有关。值得注意的是，据报道，吲哚乳酸和苯乳酸可作用于肠道上皮细胞和免疫细胞，通过芳烃受体等受体发出信号，抑制NF-κB依赖性促炎细胞因子的产生，增强上皮屏障功能，并促进抗炎免疫表型。因此，这些代谢物在CB1002 HBD上清液中的积累表明，在体内，该菌株可能使肠道组织暴露于质量上不同的代谢物谱，具有调节上皮反应和局部黏膜免疫环境的潜力。脂肪酸衍生物十六烷二酸的存在表明脂质代谢发生转变，可能与膜重塑、氧化应激或脂肪酸氧化过程中的碳溢出有关。谷氨酰胺、N-乙酰丝氨酸、吲哚乳酸和苯乳酸的存在表明硫代谢或氧化应激的重新布线。因此，在代谢转变的背景下，中间副产物积累，导致应激反应。这与核苷酸和多胺相关代谢物（如脱氧腺苷、cAMP、N8-乙酰亚精胺和N6-乙酰赖氨酸）的鉴定相符，这些代谢物与信号传导和细胞应激反应相关。这与sodA、bcp、grxC、trxB和gloA的过表达，以及氧化应激和氧化还原失衡的增加相一致。同时，黄酮类化合物（芹菜素、染料木素、天竺葵素、柚皮素和黄豆黄素）的鉴定，可能反映了帮助细菌适应代谢和环境变化的机制。这与反映趋化、鞭毛和菌毛过程的基因差异表达一致。
炎症特性分析
肠道炎症已被确定为NEC发展的重要因素。此外，在NEC中也观察到了细菌参与局部炎症。本研究调查了CB1002菌株对PBMC的体外免疫刺激特性。在与CB1002 HBD和WT活菌及细菌成分共培养后，PBMC培养上清液中各种细胞因子（包括IL-10、IL-17、IL-22和IFNγ）的水平无统计学差异，但CB1002 HBD的细菌碎片刺激产生的IL-10水平显著较低。这一发现表明，hbd缺失可能改变了细菌的细胞刺激特性。对照条件下的PBMC细胞产生的IL-10浓度高于其他实验条件，但无统计学差异。
氧化还原应激分析
氧化应激也被描述为NEC发展的一个促成因素。因此，研究分析了用不同细菌样品刺激后，Caco-2细胞中ROS、O?•–和ONOO–的产生水平。在任何测试条件下，CB1002 HBD和CB1002 WT之间的总ROS、O?•–或ONOO–水平均未观察到统计学上的显著差异。因此，在Caco-2模型中，丁酸缺陷型突变体相对于WT菌株，似乎不会差异性地促进上皮氧化还原活化。然而，与各自未刺激的对照相比，所有细菌处理条件都倾向于显示总ROS减少，同时ONOO–增加，其中WT DB、WT S和HBD S条件下检测到ONOO–的显著增加。这些发现表明，暴露于CB1002制剂与活性物质从经典ROS向活性氮物质的重新分布有关，而氧化还原调节的整体模式在WT和HBD菌株之间在该上皮模型中保持相似。尽管此处观察到的ONOO–增加是适度的且在CB1002 WT和HBD之间相当，但在不成熟、发炎的肠道中，从ROS向过氧亚硝酸盐的类似转变，即使在没有大量ROS变化的情况下，仍可能放大亚硝化损伤、促进肠细胞凋亡并损害屏障功能。在这个意义上，CB1002菌株在它们如何相互调节上皮氧化还原通路方面可能没有差异，但它们确实以某些方式参与了宿主氧化还原信号传导，在易感的新生儿肠道中，这些方式可能与已确立的NO/iNOS–过氧亚硝酸盐驱动的NEC机制相交汇。
局限性
本研究的一个局限性是，RNA-Seq分析仅从已测序的CB1002 WT基因组注释的4192个基因中识别出不到50%的表达基因。这是由于CB1002 WT基因组的自动注释仅识别了34%的基因产物，并为其余66%的基因分配了未知功能。手动注释和整理CB1002基因组可能有助于更好地分析数据。另一个局限性是，实验数据和分析仅限于细菌在丰富液体培养基中指数生长期。尽管我们证实了先前的实验数据，但这项描述性的体外工作并未考虑与肠道微生物群的相互作用，需要通过额外的实验研究进行进一步的功能验证。克服此限制的一种可能方法是使用诸如Shime或Mipro系统等装置在体外培养人肠道微生物群，然后分析暴露于产丁酸梭菌菌株后微生物群的组成和功能如何变化。
结论
产丁酸梭菌是一种肠道共生细菌，已被观察到与引起NEC的机会性病原体行为相似。然而，尚未鉴定出经典的毒力基因库，以允许明确识别致病菌株。在本研究中，我们在一个无毒力的hbd突变株中识别出差异基因表达，这表明细菌细胞过程被重新编程以补偿hbd缺失的后果。这些变化与不同水平的各种代谢物相关，并与基因表达和蛋白质相互作用网络相关联。如果这些细胞过程确实与产丁酸梭菌的生物学活动相关，它们可能涉及其致病机制。实验数据表明，当细胞模型暴露于突变株时，hbd缺失对体外炎症或氧化活性没有影响。这些结果表明，这些过程可能不导致在NEC动物模型中观察到的NEC样病变的发展。总之，我们在产丁酸梭菌中识别出几个有前景的基因靶点，特别是在NEC发病机制的背景下。构建突变体并在体外和体内环境中对其进行深入表征，将有助于识别阻碍入侵和生存的关键瓶颈。这将使我们能够评估免疫易感性，并在NEC动物模型中评估所选突变体的肠致病性。这将为验证关于产丁酸梭菌及其他相关物种作为潜在病原体的新假说铺平道路。
