《Infection and Immunity》：Klebsiella pneumoniae factors enhancing bacteremia have distinct contributions to macrophage-mediated, oxidative, and nitrosative stress resistance
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本期我们推出一篇针对革兰阴性致病菌肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的机制研究。该研究系统评估了53个已鉴定的菌血症适应性基因在抵抗巨噬细胞内杀灭、氧化胁迫（H2O2）及亚硝化胁迫（DETA NONOate）中的作用。研究发现，约60%的因子参与抵抗至少一种胁迫，但作用模式各异：荚膜（capsule）和高粘液性（HMV）影响巨噬细胞摄取而非胞内存活；DNA修复机制对多种胁迫抵抗至关重要；而转录调节因子（如ArcA、Crp、CpxR、SspA）则特异性地与亚硝化胁迫抵抗相关。尤为重要的是，细菌对亚硝化胁迫的抗性与其在巨噬细胞内的存活能力及在脾脏的感染适应性显著相关，提示在菌血症过程中，亚硝化胁迫可能是巨噬细胞杀伤的关键机制。这项工作为理解肺炎克雷伯菌如何逃避先天免疫清除提供了新见解，并指出了潜在的抗感染治疗新靶点。
本研究旨在探究肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）中那些能够增强其菌血症适应性的基因，是否以及如何帮助细菌抵抗先天免疫系统引发的关键胁迫类型，包括巨噬细胞介导的细胞内杀灭、氧化胁迫和亚硝化胁迫。
利用庆大霉素保护实验检测影响肺炎克雷伯菌胞内适应性的因子
研究人员首先建立了高通量的庆大霉素保护实验条件，以研究肺炎克雷伯菌对巨噬细胞介导胁迫的抗性。他们优化了感染复数、接触时间等参数，最终确定使用感染复数为10、接触时间为1小时且感染前不与血清孵育的条件进行后续实验。
多种肺炎克雷伯菌菌血症适应性因子影响对巨噬细胞介导的细胞内胁迫的抗性
接下来，研究评估了53个菌血症适应性基因的转座子突变体与巨噬细胞的相互作用。结果显示，野生型KPPR1菌株被巨噬细胞摄取的量很少，但所有试验中均能观察到胞内菌。多个因子似乎影响摄取，其中arn操纵子突变导致摄取显著升高，而csrD、crp和pitA突变导致摄取降低，这些模式与细菌的高粘液性水平相关。值得注意的是，高粘液性本身与细胞内存活率并无显著相关性。
在细胞内生存方面，野生型KPPR1在骨髓源性巨噬细胞中4小时后的平均存活率为42%。53个突变体中，有17个的存活率显著低于野生型。脂多糖生物合成类别中的突变体对巨噬细胞介导的胁迫尤为敏感，6个突变体中有4个出现胞内适应性丧失。代谢类别中也有部分基因对胞内生存很重要。
一个关键发现是，细菌的荚膜对于细胞内生存并非必需。两个无荚膜菌株ΔrfaH和ΔgalU虽然被巨噬细胞摄取增多，但并未表现出细胞内适应性缺陷，反而显示出比野生型更强的生存优势。这表明荚膜和高粘液性可能主要帮助细菌抵抗被巨噬细胞吞噬，但并不增强其被吞噬后的胞内存活能力。
肺炎克雷伯菌利用多种策略抵抗氧化和亚硝化胁迫
研究还评估了这些菌血症适应性因子对氧化胁迫和亚硝化胁迫的抗性。暴露于氧化胁迫后，53个突变体中有12个表现出显著的适应性丧失。所有属于复制与修复类别的基因都是抵抗氧化胁迫所必需的。暴露于亚硝化胁迫后，有16个突变体出现显著的适应性丧失。与氧化胁迫类似，参与亚硝化胁迫抵抗的因子也与DNA复制和修复有关，但与脂多糖生物合成 largely 无关。一个显著特点是，测试的所有调节因子突变体在暴露于DETA NONOate后都表现出严重的适应性缺陷，这些调节因子控制着复杂的网络，包括ArcAB和Crp代谢途径、Cpx外膜胁迫反应系统以及SspA严紧反应调节因子。
菌血症适应性基因以独特的能力增强对巨噬细胞介导、氧化和亚硝化胁迫的抗性
汇总数据显示，约60%的肺炎克雷伯菌菌血症适应性因子与抵抗这些常见先天免疫胁迫相关。具体而言，36%的因子有助于抵抗巨噬细胞介导的胁迫，36%有助于抵抗亚硝化胁迫，26%有助于抵抗氧化胁迫。
这些基因以多种且通常是不同的方式参与胁迫抵抗。例如，只有六个基因与抵抗所有三种胁迫条件相关。相反，有些基因仅与一种胁迫形式相关。此外，有些基因能增强对两种胁迫因子的抗性，但与第三种胁迫无关。
进一步分析发现，对巨噬细胞介导胁迫敏感的突变体群体，相比那些不影响胞内存活的突变体，对氧化胁迫也显著更敏感。然而，氧化胁迫生存与巨噬细胞生存整体上并无显著相关性。相比之下，被归类为对细胞内胁迫敏感的突变体对亚硝化胁迫也显著更敏感，并且所有突变体中，亚硝化胁迫暴露后的生存程度与细胞内生存程度相关。这些数据表明，肺炎克雷伯菌对氧化和亚硝化胁迫的抗性与增加的细胞内生存相关，并意味着亚硝化胁迫抗性对于单核细胞源性巨噬细胞内的适应性可能特别重要。
研究人员还将每个突变体抵抗这些胁迫的能力与其在体内菌血症期间在脾脏的相对生存进行了关联。尽管氧化胁迫对于宿主控制肺炎克雷伯菌感染很重要，但在氧化胁迫下的生存与感染期间在脾脏的适应性并不相关。相反，对亚硝化胁迫的抗性与菌血症期间在脾脏的适应性显著相关。因此，巨噬细胞可能更倾向于利用亚硝化胁迫来对抗细胞内肺炎克雷伯菌，这在脾脏环境中可能尤其相关。
研究人员还评估了肺炎克雷伯菌是否会因氧化和亚硝化胁迫而引发内源性活性氧和活性氮的生成。在亚硝化胁迫下，肺炎克雷伯菌产生了显著的ROS和RNS反应。而在氧化胁迫下，细菌未产生ROS或RNS。因此，肺炎克雷伯菌可能通过对此威胁产生内源性活性物质，而在细胞内隔室中特别容易受到亚硝化胁迫的影响。
通过热图可视化显示，与DNA修复相关的每个因子都是抵抗氧化胁迫所必需的。转录和翻译类别中的七个基因中有四个对于抵抗细胞内、氧化和亚硝化胁迫是可有可无的，表明这些因子通过独立于本研究中胁迫物的功能来增强菌血症。参与脂多糖生物合成的基因主要与抵抗巨噬细胞介导的胁迫有关，但通常不是抵抗氧化或亚硝化胁迫所必需的。14个参与代谢的基因中，有8个对于抵抗至少一种胁迫形式是重要的。调节因子类别中的每个基因都与亚硝化胁迫抗性相关，表明肺炎克雷伯菌拥有多种机制来对抗这种威胁。
为了验证突变对观察表型的直接影响，研究检查了两个基因对胁迫抗性的贡献：pdxA和mtlD。PdxA能增强肺炎克雷伯菌在菌血症性肺炎中的适应性，并在本研究中参与抵抗所有条件的胁迫。MtlD是甘露醇代谢途径的成员，对菌血症适应性很重要。MtlD是细胞内生存和亚硝化胁迫所必需的，但在氧化胁迫下是可有可无的。通过互补实验证实，PdxA和MtlD都有助于肺炎克雷伯菌在亚硝化胁迫下的生存。
讨论
本研究利用现有的肺炎克雷伯菌菌血症适应性因子数据集，研究了增强血流感染的基因与那些影响对先天免疫引发的主要胁迫类型抗性的基因之间的重叠。数据显示，肺炎克雷伯菌的适应性因子在很大程度上与巨噬细胞介导、氧化和亚硝化胁迫相关，并且这些因子通常以不同的方式促进胁迫抗性。
将肺炎克雷伯菌因子按功能类别分组有助于阐明在不同胁迫条件下重要的普遍细菌反应。DNA复制与修复类别的因子在所有三种胁迫形式中都很重要。脂多糖生物合成对于抵抗巨噬细胞介导的胁迫特别重要，但对氧化或亚硝化胁迫抵抗则不然。调节因子类别中的每个因子都与亚硝化胁迫抗性相关。这些系统调控的基因范围非常广泛，表明肺炎克雷伯菌可能需要多个系统来支持在活性氮存在下的适应性。
研究证实高粘液性与细胞内存活无关。由于高粘液性是多糖荚膜的功能，研究评估了荚膜是否是抵抗细胞内胁迫所必需的。事实上，两种不同的无荚膜肺炎克雷伯菌菌株摄取增加但未检测到适应性丧失。因此，荚膜的存在不一定带来细胞内生存优势。
脂多糖分子由三个主要区域组成：脂质A、内核和O抗原。所有三个区域生物合成的贡献基因都存在于菌血症适应性基因中。arn操纵子的成员通过添加4-氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖修饰脂质A。脂质A上L-Ara4N的存在增加了细菌表面的整体正电荷，从而能够排斥带正电荷的抗菌肽。arnD和arnF突变导致肺炎克雷伯菌高粘液性显著降低，表明由L-Ara4N传递的正表面电荷可能对多糖链的保留很重要。因此，arnD和arnF突变体比野生型KPPR1有显著更高的摄取。ArnD和ArnF都不是抵抗氧化和亚硝化胁迫所必需的。这表明L-Ara4N修饰对ROS和RNS抗性不一定重要。有趣的是，arnF突变体有明显的细胞内适应性缺陷，而arnD没有。在L-Ara4N修饰过程中，ArnD是一种细胞质酶，在L-Ara4N前体被转运到内膜之前对其进行去甲酰化。一旦进入内膜，ArnF作为翻转酶将L-Ara4N前体递送给ArnT，后者的修饰和输出是该过程的最后步骤。数据表明，在缺乏ArnF翻转酶活性的情况下，L-Ara4N在周质中的积累比当生物合成在细胞质中因缺乏ArnD而停止时对细菌适应性更有害。因此，这里观察到的arnF细胞内适应性缺陷可能是由于膜胁迫而非脂质A修饰。
GmhB对于菌血症期间脾脏和肝脏的适应性很重要，但其在发病机制中的作用似乎独立于本研究调查的胁迫因子。GmhB参与ADP-庚糖的生物合成，该糖被整合到革兰阴性菌的脂多糖内核中，并且是肺炎克雷伯菌产生正常脂多糖所必需的。可溶性ADP-庚糖也可以被巨噬细胞细胞质中的受体ALPK1检测到，导致TIFAsome形成和炎症。正常的脂多糖核心结构保护细菌免受多种类型的抗生素侵害，可能也保护其免受宿主产生的可溶性肽的侵害。由于gmhB突变体在体内具有与野生型KPPR1相似的炎症特征，并且缺乏GmhB不影响对氧化或亚硝化胁迫的抗性，数据表明正常的核心结构保护肺炎克雷伯菌免受当前研究中未检测到的胁迫因子（例如细胞外分泌的可溶性肽）的影响。或者，gmhB突变不会导致肺炎克雷伯菌脂多糖内核完全丧失。因此，有可能肺炎克雷伯菌拥有ADP-庚糖生产的冗余机制，并且GmhB在发病机制中具有尚未确定的额外、不相关的作用。
许多与代谢相关的因子对于肺炎克雷伯菌在菌血症期间的适应性很重要，这些基因中约有一半与抵抗三种胁迫形式之一有关。由于PdxA先前观察到的体外和体内表型，研究对其特别感兴趣。PdxA参与维生素B6的生物合成，并且是一个复杂的多功能操纵子的成员。在体外，PdxA保护肺炎克雷伯菌免受氧化胁迫，但其在体内的作用更为复杂。在感染期间，PdxA是肺炎克雷伯菌在肺和脾脏中适应性所必需的，然而在缺乏吞噬细胞ROS产生的小鼠中也观察到了这种表型。因此，PdxA可能在感染期间提供针对ROS和其他形式胁迫的保护。研究进一步确定PdxA保护肺炎克雷伯菌抵抗亚硝化胁迫。由于数据显示亚硝化胁迫生存与巨噬细胞生存和体内脾脏适应性相关，PdxA可能在感染期间提供针对活性氮的保护。肠杆菌目拥有多种维生素B6获取机制，包括内源性生物合成途径和从环境中 scavenge 的途径。因此，PdxA很可能在发病机制中具有超出维生素B6代谢的未被描述的作用。
在本研究中，MtlD对细胞内适应性和抵抗亚硝化胁迫很重要，但对于氧化胁迫是可有可无的。MtlD是甘露醇代谢途径的成员，将甘露醇-1-磷酸转化为果糖-6-磷酸，然后可用于糖酵解。在我们最初的转座子测序筛选中发现甘露醇代谢基因是令人好奇的，因为哺乳动物血清中甘露醇的丰度很低。然而，MtlD已在多种革兰阴性菌中被确定为菌血症适应性因子。因此，MtlD可能通过独立于在血流中利用甘露醇作为碳源的机制来保护肺炎克雷伯菌免受胁迫。在沙门氏菌中，MtlD已被提议作为治疗靶点，因为缺乏mtlD的细菌在甘露醇存在下会经历糖磷酸毒性。由于LB含有微量甘露醇，我们的mtlD突变体可能在每个胁迫实验开始时表现出低水平的糖磷酸毒性，因此更容易受到巨噬细胞和NONOate的攻击。这可能表明氧化胁迫不会像亚硝化胁迫那样加剧糖磷酸毒性。
氧化胁迫抗性与肺炎克雷伯菌发病机制在多项研究中相关，因此发现导致细菌在这种胁迫下存活率更高的突变令人惊讶。环AMP受体蛋白是一个全局调节因子，控制多种细菌操纵子和基因的转录。CRP的一个主要作用是根据环境中碳源的可用性，将细菌代谢活动转向首选的碳源，如葡萄糖。crp突变体表现出高粘液性增加，尽管这些值变化很大。因此，改变的碳代谢可能影响荚膜生物合成的效率。这反过来又影响巨噬细胞的摄取，因为crp突变体对内化有显著抗性。由于未检测到crp突变体的细胞内适应性缺陷，细胞内遇到的亚硝化胁迫水平可能未达到我们体外实验中观察到的阈值。然而，我们确实检测到与氧化和亚硝化胁迫相互作用的显著差异。crp突变导致对氧化胁迫的显著更强保护和对亚硝化胁迫的缺陷。由于CRP调控网络非常广泛，crp突变可能阻止肺炎克雷伯菌转向在氧化胁迫下不利的代谢途径。这也表明肺炎克雷伯菌对氧化和亚硝化胁迫的抗性可能涉及不同的代谢途径。对肺炎克雷伯菌的细胞内生活方式知之甚少，因此尚不清楚在这些胁迫条件下会启动哪些途径。
本研究聚焦于增强肺炎克雷伯菌在巨噬细胞内适应性的细菌因子的作用，因为该物种增强细胞内存活的因子描述很少。然而，应该注意的是，中性粒细胞在感染期间也被大量招募，并在肺炎克雷伯菌清除中发挥重要作用。由于中性粒细胞产生比巨噬细胞更强的ROS爆发，如果使用中性粒细胞，文氏图可能会发生变化。在这种情况下，我们预计更多的氧化胁迫相关因子会与增强细菌在中性粒细胞存在下生存的因子重叠。鉴于中性粒细胞在肺炎克雷伯菌感染中的重要作用，我们相信本研究中调查的许多菌血症适应性因子也会增强对中性粒细胞清除的抗性。未来的研究应进一步研究肺炎克雷伯菌与多种免疫亚群（包括中性粒细胞）的相互作用。
虽然本研究的重点是了解菌血症期间的细菌胁迫抗性，但通过解读这些模式，我们也可以更多地了解宿主-病原体相互作用。例如，为了增强细胞内生存，肺炎克雷伯菌利用一些参与氧化或亚硝化胁迫的基因，一些参与抵抗两者的基因，以及一些两者都不参与的基因。因此，肺炎克雷伯菌对巨噬细胞的防御是多方面的，需要策略来对抗不同的威胁。我们对亚硝化胁迫、细胞内胁迫和菌血症之间揭示的显著联系特别感兴趣。虽然氧化胁迫确实对宿主抵抗肺炎克雷伯菌感染很重要，但我们的数据揭示，抵抗亚硝化胁迫在巨噬细胞细胞内环境和脾脏环境中可能特别重要。进一步支持这一发现的是，我们先前的数据显示，肺中ROS产生的丧失导致肺炎克雷伯菌细菌载量显著升高，但脾脏中ROS的丧失对定植影响细微。综合来看，我们假设脾脏在菌血症期间倾向于亚硝化胁迫机制。巨噬细胞杀灭肺炎克雷伯菌的主要途径仍未解决，将是未来研究的重点。
本研究的局限性包括使用单一肺炎克雷伯菌菌株和单一巨噬细胞亚群。肺炎克雷伯菌是一种极其多样化的细菌菌株，不同的致病型可能采用独特的策略来维持感染。虽然对于少数因子可能是这种情况，但我们研究中鉴定的许多基因高度保守，可能适用于许多菌株和细菌物种。人们也认识到不同巨噬细胞亚群与病原体有独特的相互作用。我们的研究聚焦于单核细胞源性巨噬细胞，因为它们在肺炎克雷伯菌感染的各种组织中存在，并且也能以高产率获得以对多种突变体进行筛选。然而，包含不同组织驻留巨噬细胞的 niche-specific 微环境可能影响体内不同部位的这些适应性模式。本研究中使用的巨噬细胞是 naive 的，但在4小时内表现出显著的肺炎克雷伯菌杀伤水平。虽然这对本研究来说已经足够，但将巨噬细胞极化为M1或M2状态也可能影响观察到的细胞内杀伤模式。
总之，我们的研究描述了一套肺炎克雷伯菌用来增强菌血症的适应性因子工具箱。我们描述了增强菌血症的因子与增强对巨噬细胞介导、氧化和亚硝化胁迫抗性的因子之间的巨大重叠。这些数据突出了肺炎克雷伯菌如何利用多种策略来增强对多种形式胁迫的抗性。
