RNA的化学修饰会影响聚阳离子/RNA复合物的胶束组装稳定性及其在细胞内的分布

《Acta Biomaterialia》：Chemical Modifications of RNA Influence the Micellar Assembly Stability and Intracellular Distribution of Polycation/RNA Complexes

RNA递送系统的化学修饰影响及纳米载体优化研究。通过分析九种RNA化学修饰对聚离子/RNA复合物组装、细胞摄取效率及亚细胞分布的影响，发现疏水修饰（如Cy5）导致线粒体摄取而降低疗效，而亲水稳定修饰（如2’-OMe、PS）则促进胞质递送。基于抗miR-21模型验证，合理匹配RNA修饰与纳米载体结构可显著提升siRNA沉默效率及肿瘤抑制因子PTEN恢复效果。该研究建立了RNA界面化学与递送系统性能的结构-活性关系框架。

　　

王凤仪|童玉琪|卢丽静|宋月|李轩宇|王一军|张琴媛|吴军|张璐

中国广东省先进生物材料重点实验室，南方科技大学生物医学工程系，深圳518055

摘要

RNA分子在细胞内调节遗传信息方面发挥着关键作用，并逐渐成为治疗多种疾病的有前景的药物类别。将RNA递送到细胞内靶点仍然是推进基于RNA的疗法的关键挑战。目前关于RNA递送的研究主要集中在递送载体的设计和RNA的化学修饰上。然而，RNA的结构特性（尤其是化学修饰）对阳离子载体/RNA复合物的组装特性和细胞内命运的影响相对被忽视。因此，我们系统地研究了RNA的化学修饰如何影响聚阳离子/RNA复合物的胶束组装和递送特性，使用阳离子聚合物（TPE-PEG2K-8R，TP8R）作为模型载体。九种RNA的化学修饰通过调节界面相互作用，显著改变了聚阳离子/RNA复合物的组装、细胞摄取效率和亚细胞分布模式。重要的是，以抗miR-21作为治疗模型，我们发现疏水性修饰（例如Cy5）会诱导货物被线粒体摄取，从而使其失去治疗效果，而亲水性和代谢稳定的修饰（例如2′-OMe，PS）对于胞质递送至关重要。这项研究有望确立RNA界面化学作为优化核酸递送系统的关键设计参数。

意义声明

虽然RNA的化学修饰被广泛用于提高稳定性，但它们对载体/RNA组装的影响尚未得到充分探索。本研究揭示了RNA化学修饰是聚阳离子/RNA复合物组装和细胞内命运的关键调节因素。

引言

核糖核酸（RNA）分子在细胞内调节遗传物质方面至关重要，并逐渐成为治疗多种疾病的有前景的药物类别[[1], [2], [3]]。将RNA递送到细胞内靶点一直是RNA疗法中的一个关键挑战，主要是由于RNA分子在生物环境中的不稳定性及其跨细胞膜的有限渗透性[4]。增强RNA分子的化学修饰和开发潜在的递送载体是提高RNA递送效率的最常见策略[[5], [6], [7]]。阳离子聚合物和脂质纳米颗粒（LNPs）由于其明确的结构、多价性质以及在纳米尺度上的高载药能力而成为有前景的纳米载体[[8], [9], [10], [11]]。它们与RNA形成复合物，保护RNA免受降解并通过多种内吞途径增强细胞摄取[[12], [13], [14]]。另一方面，在RNA分子的特定位置引入化学修饰是一种广泛采用的策略，以增强稳定性并减少不必要的免疫激活[[15], [16], [17]]。例如，2018年获得FDA批准的开创性RNA干扰疗法Patisiran利用2′-O-甲基化（2′-OMe）修饰来提高其稳定性和递送效果[18]。最近，辉瑞-BioNTech和Moderna开发的COVID-19 mRNA疫苗加入了N1-甲基伪尿苷（m1Ψ）以提高安全性和治疗效果[[19], [20], [21]]。

然而，过度的RNA修饰可能会损害其内在功能并负面影响治疗效果[22]。一个典型的例子是m1Ψ修饰，它经常用于mRNA研究中，但意外地抑制了自扩增RNA（saRNA）的表达[23]。特别是，这些化学修饰对相同递送系统性能的微妙影响尚未受到充分关注。某些核酸的特性，包括链刚性、序列组成和分子长度，会影响它们与阳离子载体的相互作用并影响递送效率[24]。最近的一项突破性研究表明，m1Ψ介导的mRNA修饰在体外和培养细胞中都会诱导+1核糖体移码，突显了RNA修饰对翻译保真度的显著影响[25]。因此，需要进一步研究特定化学修饰对基于RNA的递送系统的影响，以改进其设计并增强其应用。

因此，我们系统地研究了RNA的化学修饰如何影响聚阳离子/RNA复合物的胶束组装和递送特性，使用阳离子聚合物（TPE-PEG2K-8R，TP8R）作为模型聚阳离子载体（图1）。TP8R由一个疏水性的聚集诱导发光（AIE）分子（TPE）、亲水性的PEG^2K、三代赖氨酸（K）树状结构和八个精氨酸（R）残基组成，形成一个阳离子基序。TP8R可以在水条件下自组装成球形胶束，胶束核心包含疏水性的TPE分子，用于定量评估RNA-TP8R的结合亲和力，而胶束表面则含有来自精氨酸和亲水性PEG分子的阳离子。阳离子纳米颗粒（TP8R-NPs）的设计更好地确保了载体与寡核苷酸之间静电相互作用的稳定性。利用这种载体，我们分析了RNA链拓扑结构（单链与双链）和九种常见位点特异性修饰对复合物组装、胶束稳定性、细胞摄取动力学和亚细胞运输的影响。此外，基于抗miR-21治疗模型，我们证明通过匹配的RNA修饰优化组装结构可以显著提高肿瘤抑制因子miR-21的沉默效果并恢复肿瘤抑制基因PTEN，为载体/货物对的设计提供了通用指南。这些发现有望建立一个结构-活性框架，以优化核酸化学设计，推进RNA疗法中的精准递送。

材料

Boc-NH-PEG-NH₂（分子量：2000 Da）购自Ponsure（中国上海）。乙醚购自HS-Science（中国深圳）。(Fmoc) Lys (Fmoc)-OH、(Fmoc) Arg (pbf)-OH、TPE-COOH及其他试剂购自Macklin（中国上海）。单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsRNA）、磺酸-Cy5标记的RNA以及磺酸-Cy5/2’OMe标记的ssRNA购自Tsingke（中国北京）。单链RNA、Cy5标记的ssRNA及其他修饰剂购自Sangon Biotech（中国上海）。所使用的dsRNA序列

TPE-PEG2k-8R模板的合成与表征

两亲性聚合物TPE-PEG^2k-8R（TP8R）和阴性对照PEG^2k-8R（P8R）是通过Boc-NH-PEG²⁰⁰⁰-NH₂的溶液相缩合反应，利用逐步肽化学方法合成的（图S1）[26]。TP8R和P8R单体的化学结构分别显示在图1(a, b)中。TP8R的分子量通过MALDI-TOF/TOF MS确认（分子量：4459 Da，图1(c)）。TP8R在水中具有优异的溶解性，并能自组装成小而均匀的球形纳米颗粒

讨论

开发潜在的RNA递送载体和RNA分子的化学修饰概念是提高RNA递送效率的最通用方法[53,54]。许多努力致力于优化载体设计，从脂质纳米颗粒到阳离子聚合物，以克服生物学障碍[55,56]。然而，RNA化学修饰对载体的相互影响尚未得到充分研究。在这项工作中，我们采用了合理的

结论

我们的发现有望有助于建立RNA界面化学框架，以优化核酸递送系统。我们的发现也可能对未来各种化学修饰RNA的设计和使用产生重大影响，强调了根据RNA的化学修饰定制核酸递送系统结构的重要性。此外，基于本研究建立的结构-活性关系，未来的工作

CRediT作者贡献声明

王凤仪：概念构思、数据管理、实验设计、方法学、数据可视化、初稿撰写。童玉琪：数据管理、实验设计、方法学验证、数据可视化。卢丽静：概念构思、方法学。宋月：方法学、数据可视化。李轩宇：实验设计、方法学。王一军：软件开发。张琴媛：实验设计。吴军：撰写——审稿与编辑。张璐：指导、撰写——审稿与编辑、资金筹集。所有作者均参与了研究

数据可用性

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补充材料

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未引用参考文献

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王凤仪：撰写——初稿撰写、数据可视化、方法学设计、实验设计、数据管理、概念构思。童玉琪：数据可视化、方法学验证、实验设计、数据管理。卢丽静：方法学设计、概念构思。宋月：方法学设计、数据可视化。李轩宇：实验设计、方法学。王一军：软件开发。张琴媛：实验设计。吴军：撰写——审稿与编辑。张璐：撰写——审稿与编辑、指导、资金筹集。