《Microbiology Resource Announcements》：Seven genome sequences of bacterial environmental isolates from the western coast of the Greenland Ice Sheet
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七个格陵兰冰盖西海岸分离株的基因组测序揭示其作为极端微生物群落的生态角色及潜在生物技术应用价值。样本经CTAB法提取DNA，采用Illumina NovaSeq测序结合PacBio HGAP长读长测序完成组装，基因组完整性达98.74%-100%。
摘要
我们报告了来自格陵兰冰盖西海岸的7种细菌分离株的基因组序列。冰盖边缘的表层冰主要由微生物组成。随着冰盖的融化，了解这种新型极端微生物群的生态作用和生物技术潜力变得非常重要。
公告
了解来自极端环境（如格陵兰冰盖）的细菌的基因组潜力，有助于发现可用于生物技术或生物修复的新化合物。为了促进这一发现，2011年6月在雅各布沙文冰川（Jakobshavn Isbrae，坐标69.589301N, ?49.783762W）南部收集了冰川融水样本（作为更大规模采样计划的一部分）。细菌在4°C、黑暗条件下于R2A琼脂平板上进行需氧培养。根据菌落形态选择并培养分离株。使用菌落大小、颜色、形状、边缘和质地等视觉特征进行亚培养。将分离株储存在-80°C的25%甘油中，并在4°C的R2A琼脂平板上培养21天。单个菌落被接种到R2A肉汤（20 mL）中，在150 rpm下摇床培养至指数期晚期。采用标准溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）方法提取DNA。
除非另有说明，否则使用默认设置。细菌菌株GrIS 1.19、GrIS 2.15、GrIS 1.11、GrIS 2.11、GrIS 2.12和GrIS 2.14的基因组序列是在Illumina NovaSeq S4平台上使用标准质量鸟枪法文库测序的（2 × 151 bp配对末端读取）。
文库使用PerkinElmer Sciclone NGS机器人液体处理工作站和KAPA Biosystems HyperPrep文库制备试剂盒（Roche）制备。使用Covaris LE220超声仪将DNA剪切至459 bp。通过两步固相可逆免疫沉淀（SPRI）技术（使用磁性珠子，Agencourt）对DNA片段进行大小筛选。片段经过末端修复、加A尾处理，并与Illumina兼容的测序接头连接。原始Illumina序列使用BBTools v38.87进行质量过滤，并使用SPAdes（版本v3.15.3；参数设置：-phred-offset 33 –cov-cutoff auto -t 16 -m 64 –careful -k 25,55,95）进行组装。长度小于1 kb的contigs被丢弃。
为了获得更高质量的大致基因组，使用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0（Pacbio）为GrIS_2_6菌株制备文库，并在Pacific Biosciences（PacBio）Sequel II平台上进行测序。使用Megaruptor 3（Diagenode）将DNA剪切至约10 kb。剪切后的DNA经过外切酶处理、DNA修复酶混合物处理和末端修复/加A尾处理，然后使用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0（PacBio）与条形码过表达接头连接。文库使用AMPure PB Beads（PacBio）纯化，并使用Sequel II Binding Kit 2.0（PacBio）与Sequel II聚合酶结合。测序使用TBD样本依赖性引物、8M v1 SMRT细胞和Version 2.0测序化学试剂，每次运行时间为1 × 900 bp。使用BBTools v38.87去除断裂的接头。长度大于5 kb的读取序列使用Hierarchical Genome Assembly Process（HGAP，smrtlink/8.0.0.80529, HGAP 4 [1.0]）进行组装。使用TensorFlow识别可能为质粒的contigs。
CRISPR元件使用CRISPR Recognition Tool（CRT）v.1.8.2或PILER-CR程序进行鉴定。所有基因组在Integrated Microbial Genomes（IMG）数据库中进行了注释（≥IMG Annotation Pipeline v.5.0.23）。使用checkM v.1.2.2估计基因组完整性。通过BLAST + 2.13.0的blastn命令行工具将获得的16S核糖体RNA基因序列与SILVA数据库138.1进行比对，以进行分类。序列详细信息见
表1。
表1 基因组特征总结
| 生物体 |
16S rRNA基因匹配百分比 |
原始读取次数 |
覆盖度（×） |
完整性（%） |
污染率（%） |
Contigs数量 |
L50/N50（bp） |
大小（bp） |
GC含量（%） |
基因数量 |
C序列数量 |
P序列数量 |
| Actimicrobium sp. GrIS 1.19 [98.2] |
13,196,650 |
376.6 |
98.96 |
0.4 |
91 |
11/118,791 |
4,177,960 |
60.57 |
4,008 |
1 |
3 |
| Cryobacterium sp. GrIS_2_6 [99.6] |
291,115 |
221.7 |
98.74 |
2.15 |
2 |
1/4,227,007 |
4,344,596 |
66.70 |
4,361 |
– |
1 |
| Glaciihabitans sp. GrIS 2.15 [97.2] |
9,819,950 |
395.3 |
99.49 |
0.51 |
37 |
5/279,211 |
3,782,709 |
63.50 |
3,805 |
1 |
– |
| Oxalobacteraceae sp. GrIS 1.11 [98.9] |
13,987,370 |
276.8 |
99.55 |
1.66 |
178 |
18/106,551 |
6,495,031 |
61.20 |
6,018 |
– |
| Oxalobacteraceae sp. GrIS 2.11 [97.2] |
11,708,220 |
316.5 |
99.92 |
0.3 |
155 |
21/79,900 |
5,120,017 |
46.89 |
4,733 |
2 |
– |
| Undibacterium sp. GrIS 1.2 [98.6] |
19,293,144 |
271.1 |
100.0 |
0.69 |
99 |
7/272,887 |
5,649,109 |
63.33 |
5,650 |
– |
| Variovorax sp. GrIS 2.14 [99.0] |
19,293,144 |
271.1 |
100.0 |
0.69 |
99 |
7/272,887 |
5,649,109 |
63.33 |
5,650 |
– |
致谢
本工作得到了NASA Exobiology项目（编号80NSSC18K0814）对C.M.F.的支持，以及美国国家科学基金会（NSF）通过项目编号NSF 2037963对H.J.S.和C.M.F.的支持。K.C.还获得了NSF NRT-2125748奖学金的资助。
我们衷心感谢M. Tedesco以及NSF 0909388项目对野外采样工作的支持。本文中表达的任何观点、发现、结论或建议仅代表作者个人观点，不一定反映NASA或美国国家科学基金会的立场。
美国能源部联合基因组研究所（JGI）的工作是由能源部科学办公室资助的，合同编号为DE-AC02-05CH11231。这些数据是为JGI提案#505037生成的。
