《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：Integrated Multi-Scale Characterization of Recombinant Alkali-Thermostable Keratinase (
Bacillus velezensis strain ZBE1) for Sustainable Keratin Waste Bioprocessing
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本研究成功克隆并表达Bacillus velezensis ZBE1菌株的重组角蛋白酶，通过分子光谱技术（MALDI-TOF-MS、CD）和热分析（TGA、DTA）验证其39.14 kDa分子量、高碱性和热稳定性。该酶对鸡毛降解效率高，支持大肠杆菌生长，并证实其在皮革脱毛、凝血块溶解及生物催化等领域的应用潜力。
Zabin K. Bagewadi | Neha P. Bochageri | T.M. Yunus Khan | Archana G. Revankar | Dhananjaya G | Nilkamal Mahanta | Gouri H. Illanad | Shaik Mohamed Shamsudeen
生物技术系，KLE技术大学，卡纳塔克邦Hubballi，580031，印度
摘要
本研究报道了来自Bacillus velezensis菌株ZBE1的重组角蛋白酶的应用。角蛋白酶基因被鉴定、克隆并在E. coli BL21 (DE3)中表达。纯化的重组角蛋白酶的分子量为39.14 kDa。该酶具有高度碱性和热稳定性，并通过热力学性质得到了验证。它对角蛋白azure和N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酸4-硝基苯胺表现出强烈的特异性。实验表明其能有效降解鸡羽毛，这一结果通过傅里叶变换红外光谱和扫描电子显微镜得到了证实。角蛋白水解物支持了E. coli的生长，表明这是一种可持续的方法。此外，该酶还显示出脱毛作用和溶解血栓的纤维蛋白溶解活性。基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱技术进一步确认了重组角蛋白酶的身份。N端序列分析和Edman降解显示其与Bacillus属S8家族肽酶的角蛋白酶序列具有同源性。通过圆二色光谱、热重分析和差热分析对蛋白质进行了表征。计算工具分析表明该酶属于S8家族肽酶。分子对接研究评估了其与N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酸4-硝基苯胺的结合亲和力。分子动力学模拟显示了在整个过程中的配体稳定性。这些结果表明重组角蛋白酶在角蛋白废物管理中具有潜在的应用价值。
引言
据预测，到2050年全球人口将达到100亿，从而对食品需求产生巨大压力。家禽生产将为此做出重要贡献，年产量可达1.5亿吨，并且多年来持续增长（Lu等人，2024年）。这导致了每年产生超过8000万吨的羽毛废物（M. Yan等人，2025年）。羽毛是一种富含角蛋白的废物，具有高角蛋白含量和高度耐化学性的结构（Alhomaidi，2025年）。角蛋白丰富蛋白质的积累进一步加剧了环境污染并影响人类健康（M. Yan等人，2025年）。角蛋白污染的水体通过酸化和富营养化过程造成环境破坏（Khan等人，2024年）。处理这些废物面临重大挑战，并增加了环境问题（X. Yan等人，2025年）。因此，合理利用角蛋白废物已成为亟待解决的问题（Peng等人，2023年）。因此，将角蛋白丰富的废物转化为有价值的产品已成为重要的研究方向（Khan等人，2024年）。角蛋白是一种不溶性的纤维蛋白，含有丰富的半胱氨酸和二硫键，这些结构使得酶难以发挥作用。探索能够通过靶向二硫键降解稳定角蛋白结构的角蛋白酶可能为解决角蛋白废物问题提供有效方案，从而将其转化为高附加值产品，这使得角蛋白酶成为研究热点（Hassan等人，2020年）。角蛋白酶（EC 3.4.21/24/99）属于丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，能够通过断裂肽键和还原二硫键来催化角蛋白结构（Rai和Hasija，2024年）。根据保守结构和活性位点的存在，角蛋白酶被归类为S1、S8、S9、S10、S16、M3、M4、M14、M16、M28、M32、M36、M38和M55等不同家族。大多数研究的角蛋白酶属于S8蛋白酶家族（Li等人，2024年；X. Yan等人，2025年）。现有的角蛋白酶研究需要进一步探索其实际应用。角蛋白分解的复杂机制尚未完全明了。研究表明，分解过程包括蛋白质水解后二硫键的断裂，从而提高其溶解性。负责角蛋白分解的角蛋白酶可以分为内肽酶（水解肽链内部的肽键）、外肽酶（靶向肽链末端的肽键）和寡肽酶（攻击较小多肽中的肽键，将其转化为二肽或三肽或游离氨基酸）（Saeed等人，2024年）。由于微生物角蛋白酶易于生产且具有高效降解角蛋白的特性，因此比其他来源更受青睐（Akram等人，2022年）。Bacillus属菌株因其较高的滴度、较短的生产周期、易于纯化以及可进行基因操作而受到广泛应用（X. Yan等人，2025年）。角蛋白酶在多个领域具有重要应用，如皮革工业中的脱毛（替代有害化学方法）、生物添加剂洗涤剂中的高效清洁机制、农业产业中将羽毛转化为经济上有价值的蛋白饲料、氨基酸、制药和生物医学（Akram等人，2022年）、纺织品以及皮肤病的治疗（Peng等人，2023年）。表面活性剂稳定的角蛋白酶在化妆品领域也很重要，已经开发出一些用于这些应用的角蛋白酶（Kim等人，2025年）。角蛋白酶还用于纳米粒子生物合成、药物递送和朊病毒生物降解。重组角蛋白酶因其能够用环保方法降解难溶的角蛋白基底物而越来越受欢迎（Kumari等人，2024年）。天然角蛋白酶的产量和活性较低，应用范围有限，因此需要通过基因工程方法开发具有所需特性的新型酶（Neog等人，2023年）。虽然已经克隆和表达了多种角蛋白酶，但其生产力和催化活性较低，限制了其应用。因此，研究具有更好催化力的角蛋白酶变得十分必要。从潜在菌株中鉴定角蛋白酶基因并在异源系统中表达是一种合理的方法（Peng等人，2023年）。Escherichia coli由于其遗传结构和支持多种载体而成为广泛使用的表达宿主（Kumari等人，2024年）。多种工程表达菌株，如E. coli、Bacillus属和Pichia属，已被用于异源表达（Li等人，2023年）。Bacillus subtilis的基因分泌表达系统提高了产率和活性（Li等人，2023年）。定点突变和改良的启动子被用于提高角蛋白酶的稳定性和特异性（X. Yan等人，2025年）。蛋白质工程通过多种突变方式改善了酶的性质（Kumari等人，2024年）。融合技术产生了可用于连续工业反应的多功能酶（Kumari等人，2024年）。启动子工程策略已被开发用于增强Streptomyces基因的表达（Lu等人，2024年）。利用计算技术进行合理设计，以分析和设计分子间蛋白质相互作用，实现热稳定性和高通量筛选角蛋白酶的底物特异性（Pei等人，2024年）。然而，关于高滴度重组角蛋白酶生产的文献有限。在广泛温度和pH范围内具有高活性和特定行为的角蛋白酶受到青睐。动力学和热力学研究提供了关于酶热稳定性的信息，为应用提供了依据。角蛋白酶的广泛应用激发了对其新型特性的研究（Alamnie等人，2023年）。此外，利用先进分析技术（如基质辅助激光解吸电离/质谱和计算机辅助in-silico方法）探索角蛋白酶的结构和功能特性也变得重要（Akram等人，2022年）。开发高效、环保和可持续的角蛋白酶基产品已成为研究重点（Akram等人，2022年）。角蛋白酶的重要性和高需求促使人们不断探索其在各个领域的功能和应用（Rai和Hasija，2024年）。当前研究中详细报道了从先前分离的Bacillus velezensis菌株ZBE1中获得的重组角蛋白酶的生化性质、结构和功能特征（Revankar等人，2023a）。然而，关于具有优异热稳定性和高效降解鸡羽毛能力的B. velezensis重组角蛋白酶的文献较少，且关于角蛋白水解物支持E. coli生长的应用也较少，这表明其在介质配方中具有潜在的应用价值。角蛋白酶基因通过pALM载体在E. coli BL21 (DE3)中鉴定并克隆后进行了表达。亲和层析纯化的重组角蛋白酶在多种生化指标上进行了表征，如不同条件下的稳定性、热力学性质和动力学。纯化的重组蛋白通过基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）和圆二色（CD）光谱技术以及热重分析（TGA）和差热分析（DTA）在分子水平上进行了表征。计算工具（如分子对接和分子动力学（MD）和模拟）被用于评估其结构和功能特性。此外，该研究还报道了重组角蛋白酶在羽毛废物管理中的多种应用，包括使用扫描电子显微镜（SEM）和傅里叶变换红外（FTIR）光谱、皮革加工和医疗保健领域。
化学物质、酶和载体
本研究中使用的分析级（AR）化学品和基质购自Merck and Co. Inc.（美国）和Sigma-Aldrich Pvt Ltd.（美国）。角蛋白酶基因是从分离和保存的B. velezensis菌株ZBE1中鉴定出来的。克隆和表达过程中使用了pALM（His标签）载体、BamHI和NotI限制性内切酶、E. coli DH5α和E. coli BL21 (DE3)。鸡羽毛、山羊皮和血液来自当地农场和商店。
目标基因的识别
基因识别是基因克隆的首要和关键步骤，通过使用生物信息学工具精确完成。选择了与亲本序列（B. velezensis菌株ZBE1的16s rRNA序列）高度相似（>99%）的序列，以便在整个基因组序列中识别角蛋白酶基因，并进一步使用Clustal Omega MSA工具进行比对（Revankar等人，2023a）。最终鉴定出一个角蛋白酶基因，其长度为382个碱基对。
结论
B. velezensis的角蛋白酶基因在E. coli BL21 (DE3)中成功表达。亲和纯化的角蛋白酶为39.14 kDa的蛋白质，表现出碱性和热稳定性。基于热力学特性验证了其热稳定性。该酶对角蛋白azure和N-琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酸4-硝基苯胺表现出强烈的底物特异性。此外，它在多种影响因素下表现出稳定性，并归类为丝氨酸蛋白酶。
CRediT作者贡献声明
Shaik Mohamed Shamsudeen： 资金获取、正式分析。
Gouri H. Illanad： 写作 – 审稿与编辑、方法学。
Archana G. Revankar： 写作 – 初稿、方法学。
T. M. Yunus Khan： 正式分析。
Nilkamal Mahanta： 写作 – 审稿与编辑、正式分析。
Dhananjaya G： 正式分析。
Neha P. Bochageri： 方法学、研究。
Zabin K Bagewadi： 写作 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、资源管理、项目协调。
未引用参考文献
Sarkar和AuthorAnonymous, 2020; Yan等人，2025。
数据可用性
本研究生成和分析的所有数据均包含在文章中。
人类和动物受试者使用伦理声明
不适用。
出版同意
所有作者同意在《Bioresources and Bioprocessing》期刊上发表该手稿。
利益冲突
所有作者确认没有利益冲突。
资助
本研究得到了沙特阿拉伯Abha地区King Khalid University科学研究部的支持，通过小型研究项目RGP. 1/60/46资助。
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
作者感谢King Khalid University科学研究部的支持，通过小型研究项目RGP. 1/60/46资助了本研究。第一作者（通讯作者）感谢KLE技术大学在能力建设项目中的支持。作者还感谢Dharwad的印度理工学院提供的设施。
