《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects》：ST3GAL3-mediated selective α2,3-sialylation of LDLR promotes vesicular stomatitis virus entry
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VSV-G依赖LDLR进入机制中ST3GAL3介导的α2,3唾液酸化起关键作用，其他STs无法补偿。通过敲除ST3GAL3/4/6并检测病毒结合、摄取和转导效率，结合流式细胞术、荧光显微和质谱分析，发现ST3GAL3缺失导致LDLR N-糖链α2,3唾液酸化减少，显著降低VSV感染效率，补充ST3GAL3可逆转此现象。
作者：Tomoya Isaji、Feng Qi、Yu-Chun Chien、Yoshiyuki Oyama、Tomohiko Fukuda、Kay-Hooi Khoo、Jianguo Gu
所属机构：东北医科药科大学分子生物膜与糖生物学研究所，日本宫城县仙台市青叶区小松岛4-4-1，邮编981-8558
摘要
背景
囊性口炎病毒（VSV）是一种典型的弹状病毒，其感染性主要由其包膜糖蛋白（VSV-G）决定。低密度脂蛋白受体（LDLR）作为一种细胞表面糖蛋白，已被确定为VSV-G结合的主要受体。然而，宿主唾液酸化在VSV-G介导的病毒入侵过程中的作用仍不明确。
方法
使用流式细胞术、荧光显微镜和Western blotting技术，在缺乏β-半乳糖苷α2,3-唾液酸转移酶3（ST3GAL3）、4（ST3GAL4）或6（ST3GAL6）的HeLa细胞中评估了病毒的结合、摄取和转导过程。通过凝集素结合和重组可溶性LDLR的LC-MS/MS糖蛋白组学分析来检测LDLR的唾液酸化情况。
结果
ST3GAL3敲除（KO）显著降低了病毒的结合、摄取和转导能力，而重新表达ST3GAL3后这种效应得到了逆转。ST3GAL3的缺失导致内源性LDLR N-糖链的α2,3-唾液酸化减少，这一结果通过Maackia amurensis凝集素的结合得到了证实。LC-MS/MS分析也显示重组LDLR的唾液酸化糖型存在特异性减少。
结论
在HeLa细胞中，LDLR N-糖链的ST3GAL3依赖性唾液酸化对于病毒的有效入侵是必需的，ST3GAL4或ST3GAL6无法替代这一功能。
总体意义
这些发现揭示了一条对VSV-G介导的感染至关重要的特定糖基化途径，并表明ST3GAL3可能是调节病毒嗜性的潜在靶点，这对溶瘤性VSV策略具有潜在应用价值。
引言
囊性口炎病毒（VSV）是一种负链非分段RNA弹状病毒，在病毒学和基因传递研究中得到广泛应用。由于其广泛的宿主范围、快速复制能力和高效的异源基因表达能力，人们开发出了基于VSV-G的假型慢病毒载体和溶瘤性VSV平台[[1], [2], [3], [4]]。VSV-G能够高效地附着并进入多种细胞类型；然而，VSV感染性的分子决定因素尚未完全阐明。
唾液酸化是指通过唾液酸转移酶（STs）将唾液酸添加到糖蛋白和糖脂上的过程，在细胞间通讯、免疫调节和受体功能中起着关键作用。这一过程的失调会促进肿瘤进展和治疗抵抗[5]。Schachter及其同事对N-糖链分支的经典研究表明，不同的唾液酸转移酶会产生具有不同生物学功能的糖链结构[6]，这为当前针对特定亚型的糖基化模型提供了理论基础。在β-半乳糖苷α2,3-唾液酸转移酶中，ST3GAL3、ST3GAL4和ST3GAL6分别转移α2,3-连接的唾液酸，它们的底物偏好有部分重叠但存在差异。这些酶的活性不仅受转录水平调控，还受高尔基体定位等因素的影响[[7], [8], [9], [10]]。这些亚型特异性的模式可能反映了高尔基体内底物可及性的差异，其中微环境和酶的组织结构决定了每种亚型能够接触和修饰哪些糖链[[11], [12], [13]]。先前对细胞表面sLex和sLea结构的研究表明，ST3GAL3和ST3GAL4起主要作用，而ST3GAL6的参与度较低，这与报道的底物偏好差异一致[14,15]。鉴于α2,3-唾液酸化可以调节配体识别和信号传导，因此亚型依赖性的唾液酸化调控可能具有不同的功能后果。尽管ST3GAL3传统上被认为主要作用于糖脂，但越来越多的证据表明，这些酶也具有蛋白质水平的底物特异性。例如，ST3GAL4选择性修饰整合素和促红细胞生成素，而ST3GAL6则主要针对EGFR[17,18]。因此，ST3GAL3也可能作用于某些糖蛋白底物；然而，它对细胞表面受体N-糖链唾液酸化的具体作用仍不明确。
低密度脂蛋白受体（LDLR）是VSV-G介导病毒入侵的主要受体，其他LDLR家族成员作为替代受体时效率较低[19,20]。LDLR具有丰富的N-和O-糖基化修饰，这些糖链影响受体的成熟、折叠、表面稳定性和配体结合[21], [22], [23]，这表明LDLR的特异性糖基化可能调节VSV-G的入侵。实际上，LDLR的折叠遵循一个协调的共翻译途径，其中上游区域和适当的N-糖链加工起着关键作用，突显了糖链结构在调节LDLR功能中的重要性[24]。
许多病毒利用末端唾液酸结构附着并进入宿主细胞。流感病毒区分α2,3-和α2,6-连接的唾液酸，而多瘤病毒、轮状病毒和腺病毒则识别不同的唾液酸化糖链结构[[25], [26], [27], [28], [29], [30]]。其中，α2,3-连接的唾液酸对病毒的宿主特异性和入侵尤为重要，例如禽流感病毒和某些肠道或呼吸道病毒[31]。虽然细胞表面唾液酸化的整体变化会影响VSV的感染性[[32], [33], [34]]，但α2,3-唾液酸化在VSV-G识别中的作用尚未明确，相应的α2,3-唾液酸转移酶也尚未鉴定。
在本研究中，我们利用敲除或恢复ST3GAL3、ST3GAL4或ST3GAL6的HeLa细胞系探讨了α2,3-唾液酸化在VSV入侵中的作用。为了评估这些酶是否参与LDLR的唾液酸化，我们使用了Maackia amurensis凝集素（MAM）来检测内源性LDLR，该凝集素优先识别复杂的N-糖链上的α2,3-连接的唾液酸。为了分析特定位置的糖基化变化，我们对在293T细胞中表达的重组LDLR胞外域进行了LC-MS/MS分析。这种方法使我们能够比较野生型和ST3GAL3缺失条件下的N-和O-糖基化位点的修饰情况。结果表明，ST3GAL3介导的LDLR N-糖链α2,3-唾液酸化在VSV-G介导的病毒入侵中起关键作用。
抗体和试剂
使用的抗体和试剂包括：小鼠抗-α-微管蛋白（T6199）和抗-VSV-G（V5507）（Sigma）；抗-GFP（600–101-215）（Rockland Immunochemicals）；抗-LDLR（ab52818）（Abcam）。二抗包括抗小鼠（AP124P）和抗山羊（AB324P）（Millipore），以及抗兔（7074）（Cell Signaling Technology）。还使用了Alexa Fluor 488标记的抗小鼠IgG（A11029）（Invitrogen）和TO-PRO-3（T3605）（Molecular Probes）。此外还使用了MAM琼脂糖（J310）和Sambucus sieboldiana。
ST3GAL3对HeLa细胞中VSV-G假型慢病毒感染的影响
最新研究表明，ST3GAL3、ST3GAL4和ST3GAL6修饰不同的糖蛋白并发挥不同的生物学功能[18]。为了评估这些酶对VSV-G假型慢病毒感染的影响，将野生型（WT）和三种ST3GAL3敲除的HeLa细胞系用表达GFP的VSV-G假型慢病毒以MOI为10进行感染（图1A）。感染48小时后，WT、ST3GAL4-KO和ST3GAL6-KO细胞均显示出强烈的GFP信号。相比之下，ST3GAL3-KO细胞则表现出...
讨论
本研究表明，ST3GAL3介导的α2,3-唾液酸化是VSV-G假型慢病毒感染的关键决定因素。敲除ST3GAL3显著降低了病毒在HeLa细胞中的结合、入侵和转导能力。重新表达ST3GAL3可以恢复病毒的感染性，证实这一表型直接由该酶的缺失引起。相反，敲除ST3GAL4或ST3GAL6并未影响感染能力，反而略有增强。
资金来源
本研究部分得到了日本学术振兴会（JSP）和中央研究院（AS-IR-113-L04）的科研资助（编号23K27133、24K09817和25K09941）。
作者贡献声明
Tomoya Isaji：撰写、审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法设计、资金获取、数据分析、概念构建。
Feng Qi：数据可视化、验证、实验设计、数据分析。
Yu-Chun Chien：撰写、审稿与编辑、实验设计、数据分析。
Yoshiyuki Oyama：方法设计、实验设计。
Tomohiko Fukuda：实验设计、资金获取、数据分析。
Kay-Hooi Khoo：撰写、审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突和财务利益冲突。
致谢
作者仅在稿件准备过程中使用ChatGPT（OpenAI）进行语法和拼写编辑。所有科学内容均由作者撰写、审核并批准，作者对文本内容负全责。我们感谢中央研究院的质谱与蛋白质修饰分析设施（项目编号AS-CFII-111-209）提供的MS数据支持。
