《Bioelectrochemistry》：N-terminal CBM3 fusion: A key factor for designing a stable cellulose-specific binding lactate oxidase sensing element
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L-乳酸氧化酶（L-LOD）与CBM3融合构建新型电化学传感器，通过计算和实验筛选出CBM3-LOD和CBM3-Linker-LOD具有最佳催化活性与稳定性，实现低至0.00296 mM检测限、高灵敏度26.48 μA.mM?1 cm?2及超15天稳定性，血清测试显示99.4-100.53%回收率。
岳绍|宣丽|易宇|宋春宇|王欣|黄小珍|杨敏|王炳莲|王琦|刘青改|马瑶红|龚伟莉
齐鲁工业大学（山东省科学院）生物研究所，中国山东省济南市历城区经世东路28789号，邮编250103
摘要
L-乳酸是临床诊断、运动生理学和食品工业中的关键生物标志物，这推动了对可靠检测方法的需求。基于L-乳酸氧化酶（L-LOD）的电化学生物传感器具有显著优势，但其性能在很大程度上取决于有效的酶固定技术。本研究开发了一种新型生物传感平台，通过构建L-LOD与碳水化合物结合模块（CBM3）的融合酶，实现了在纤维素膜上的一步定向固定。在将CBM1、CBM2或CBM3整合到L-LOD的N端/C端的七种构建体中（无论是否添加连接子），只有N端融合体CBM3-LOD和CBM3-Linker-LOD成功表达了催化活性。计算分析表明，其他融合体（如LOD-CBM2、CBM2-Linker-LOD）的失败是由于空间位阻和关键残基丢失，阻碍了底物的结合路径。所得到的固定CBM3-LOD生物传感器表现出优异的性能：线性范围宽（0.0625–0.5 mM），检测限极低（0.00296 mM），灵敏度高（26.48 μA·mM?1·cm?2），并且操作稳定性优异（15天后活性保留超过50%）。实际血清样本分析证实了其高准确性（回收率99.4–100.53%）和出色的抗干扰能力。本工作确立了CBM3介导的固定作为开发高性能生物传感器的优越策略，并为功能性融合多聚酶的合理设计提供了框架。
引言
L-乳酸是厌氧代谢途径中的关键代谢物，正常血液浓度范围为0.5至2.2 mmol/L。然而，在剧烈运动期间，这一水平可上升至12–25 mmol/L。因此，L-乳酸水平被广泛用作临床诊断中评估疾病严重程度和治疗反应的定量参数，或在体育运动中评估体能的指标[1]。此外，乳酸检测在食品和发酵工业中也很重要。一些产品（如葡萄酒、啤酒、苹果和乳制品（牛奶、奶酪、酸奶、黄油）的新鲜度、质量和发酵过程都部分依赖于乳酸水平[2][3]。因此，乳酸浓度的检测具有重要的实际价值，并引起了科学界的广泛关注和深入研究。
与其他传统的乳酸检测方法相比，使用固定L-乳酸氧化酶（L-LOD）作为传感元件的电化学生物传感器具有多种优势，如操作简便、高特异性、快速响应和最小化的样品制备[4]。L-LOD（EC 1.1.3.2）属于FMN依赖的α-羟基酸氧化酶家族（HAOx；S)-2-羟基酸：氧气2-氧化还原酶，通过其FMN辅因子的两电子还原催化α-羟基酸氧化为α-酮酸。这种还原随后驱动两个电子和两个质子从还原型辅因子FMNH?转移到O?，生成H?O?和α-酮酸，同时辅因子最终恢复到其氧化形式。H?O?可以在电极上被氧化，产生的电流与L-乳酸浓度成正比[5]。在生理条件下，L-LOD呈现近乎对称的四聚体结构。每个蛋白质亚基由大约374个氨基酸和一个FMN分子组成，整个四聚体的分子量约为160 kDa。在每个亚基内，氨基酸链折叠成α/β桶状结构，桶底有2条短β链和15条大小不一的α螺旋。FMN结合位点和催化活性位点都位于桶的C端。残基190–220形成一个动态盖状结构，覆盖活性位点，在底物结合和产物释放中起重要作用[6]。对HAOx家族氨基酸序列的比较分析表明，这一动态盖环区域的序列保守性最低[7]。
在制备酶电极生物传感器的过程中，酶固定是最重要的步骤。最近，通过表达和偶联重组融合标签（如碳水化合物结合模块（CBMs）实现的自组装酶固定成为一种有吸引力的方法。这种方法允许酶以确定的方向一步附着在纤维素修饰的电极界面上，有效避免固定过程中的酶变性和活性丧失[8]。此外，CBMs与电极界面之间的强亲和力确保了在分析过程中结合不会轻易被破坏，从而保证了生物传感器的良好稳定性和重复性。在我们之前的研究中，已将葡萄糖氧化酶[9]、葡萄糖脱氢酶[10]和尿酸氧化酶[11]等CBM融合酶成功固定在CBMs的亲和支持纤维素上，从而提高了传感性能。因此，构建合成的CBM融合L-LOD也可能对L-乳酸生物传感器有益。然而，迄今为止，大多数研究L-乳酸生物传感器的研究都集中在一种特定的商业可用Aerococcus viridans来源的LOx（AvLOx）上。只有少数关于具有改变稳定性的突变AvLOx、动力学性质或与氧气反应性的研究被报道。因此，关于实验表征的L-LOD序列-结构-功能关系及其多聚体结构的有限信息，对其CBM融合版本的构建构成了重大挑战。
串联融合相对容易构建融合酶。这种策略在某些情况下有效，即融合伙伴的物理化学性质顺序正确，并且组分蛋白质的灵活、无结构的N端或C端区域起到“桥梁”作用，为蛋白质域之间提供足够的空间，使其正确折叠。然而，当自由N端或C端在母体蛋白质的功能中起关键作用，或者其灵活性不足或过长而无法规避空间位阻时，这种方法无效。空间位阻会降低蛋白质动力学的自由度，常常导致不良结果，如错误折叠、聚集（导致包涵体形成）、蛋白质生产产量低和生物活性降低[12]。因此，通常需要连接肽来连接融合伙伴，因为它们有助于更好地保持每个融合组分的个体结构完整性和功能活性。随着计算程序（如AlphaFold、PyRosetta）的发展，这些程序专门用于结构预测，有望阐明融合蛋白质的结构-功能关系，并帮助设计具有所需特性和可预测行为的酶。
在本研究中，利用基因工程技术，将来自不同来源的CBMs与野生型L-LOD融合。构建并表达了多种融合酶序列。最终获得了两种具有催化活性的融合酶，即CBM3-LOD和CBM3-Linker-LOD。通过计算辅助方法，深入分析了其他融合酶表达失败和失活的原因，以及两种成功表达的融合酶之间稳定性差异的因素。随后，测试了它们的酶学性质和纤维素结合能力。使用这两种融合酶（CBM3-LOD和CBM3-Linker-LOD）和纤维素膜作为材料，构建了两种生物传感器的敏感元件。最后，系统研究了构建的CBM3-LOD和CBM3-Linker-LOD传感器的线性范围、检测限、重复性、稳定性、抗干扰能力和检测能力。这项研究为L-LOD融合酶的构建提供了宝贵的实验和计算经验，并为L-乳酸传感元件的合理设计奠定了基础。
材料和化学试剂
L-乳酸（60%溶液）、2,4-二硝基苯肼（DNP）、咪唑、硫酸卡那霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自Sangon Biotech（上海，中国）。K?HPO?、KH?PO?、十二烷基硫酸钠（SDS）、K?[Fe(CN)?]和戊二醛购自Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.（上海，中国）。质粒提取试剂盒购自Vazyme Biotech Co., Ltd.（南京，中国）。牛血清白蛋白（BSA）购自Beijing Solarbio
CBM融合L-LOD的异源表达和表征
融合酶的稳定性和催化效率与两个关键因素密切相关：酶内不同结构域的排列顺序和连接子的性质[24]。如图1所示，利用已确认的CBM1、CBM2和CBM3的纤维素结合能力[25]，我们分别在野生型LOD基因序列的N端或C端插入了不同的CBM基因序列。这种设计策略最终产生了五种融合体
结论
本研究系统地探讨了CBM融合L-LOD的设计、表征和生物传感应用，得出了指导基于LOD的生物传感器开发的关键发现。通过将CBM1、CBM2或CBM3整合到LOD的N端/C端（无论是否添加连接子），构建了七种CBM-LOD融合体。异源表达和酶学表征表明，只有将CBM3结构域连接到LOD N端的融合酶（即CBM3-LOD）具有...
CRediT作者贡献声明
岳绍：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，方法学，研究，数据管理。
宣丽：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，监督，方法学，数据管理。
易宇：方法学，研究。
宋春宇：方法学，研究。
王欣：可视化。
黄小珍：方法学，研究。
杨敏：方法学。
王炳莲：方法学，研究。
王琦：方法学。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划（2022YFC3401302）、国家自然科学基金（32101222）、济南大学人才项目（202228084）以及齐鲁工业大学（山东省科学院）的关键创新项目（2024ZDZX03）的资助。
