基于聚氧乙烯醚（Poloxamer）的CPV病毒样颗粒疫苗的制备及其在小鼠体内的免疫学评价

《Biologicals》：Preparation of poloxamer-based CPV virus-like particle vaccine and its immunological evaluation in mice

犬细小病毒CPV-2c的病毒样颗粒（VLPs）通过原核表达系统制备，并与优化后的温敏水凝胶（含17% P407、3.2% P188、0.3% HPMC，凝胶温度35.8℃）结合，形成新型疫苗递送系统。体外释放实验显示BSA在48小时内累计释放98.2%，符合Weibull动力学模型。体内免疫实验表明该疫苗显著增强小鼠免疫反应，血清IgG达1:3×10^5，中和抗体效价1:300，优于裸VLP组且抗体持久性更佳。该研究为开发新型CPV疫苗及温敏水凝胶递送系统提供依据。

　　

费莫（Fei Mo）| 钱静（Jing Qian）| 唐叶平（Yeping Tan）| 毕振伟（Zhenwei Bi）| 欧阳伟（Wei Ouyang）| 王永山（Yongshan Wang）| 江山香（Shanxiang Jiang）

中国江苏省农业科学院兽医研究所，南京，210014

摘要

聚氧乙烯醚（Poloxamers）是一种热敏型三嵌段共聚物，因其安全性和缓释特性而受到重视。利用中国常见的犬细小病毒（CPV）CPV-2c株（JSLYG-18），我们通过原核表达技术制备了类病毒颗粒（VLPs），并开发了一种热敏型聚氧乙烯醚凝胶疫苗。实验结果表明，该热敏凝胶的最佳配方为：聚氧乙烯醚407（P407）17%、聚氧乙烯醚188（P188）3.2%和羟丙基甲基纤维素（HPMC）0.3%，其凝胶化温度（T_m）为35.8°C，显示出优异的稳定性和易于制备的特点。体外药物释放研究表明，BSA从聚氧乙烯醚凝胶中释放的时间超过48小时，累积释放率为98.2%，符合Weibull动力学模型，表明药物扩散和凝胶侵蚀之间存在协同作用。基于聚氧乙烯醚的VLPs疫苗在小鼠体内表现出最小的组织刺激性和增强的免疫反应，包括脾淋巴细胞的激活。免疫后，血清IgG水平达到1:3 × 10⁵，中和抗体滴度达到1:300，这些指标均显著高于仅含VLPs蛋白的对照组，且抗体持久性更长。这些发现表明，基于聚氧乙烯醚热敏凝胶的CPV VLPs疫苗不仅具有优异的免疫原性，还是一种有前景的疫苗递送平台。

引言

疫苗是预防病原微生物感染最有效的策略。其免疫原性取决于多种因素，包括抗原/佐剂的选择、给药途径和递送系统。理想的疫苗递送系统应能促进抗原的呈现、维持抗原稳定性并增强免疫效力。然而，现有的兽医疫苗递送系统面临稳定性差、代谢清除效率低、非特异性免疫干扰以及与应激相关的不良反应等挑战。聚氧乙烯醚水凝胶是一种广泛使用的医疗材料，不仅具有缓释作用和保持蛋白质类药物稳定性的功能，还具有增强免疫的作用[1]，因此作为疫苗递送系统具有巨大潜力。

聚氧乙烯醚是一种PEO-PPO-PEO三嵌段共聚物，由亲水性聚环氧乙烷（PEO）链和疏水性聚环氧丙烷（PPO）链通过共价键连接而成，具有优异的热敏相变特性[2]。通过调整非离子表面活性剂的组成和嵌段比例，可以改变其对水或油的亲和性，从而实现多种应用。由于其低毒性，聚氧乙烯醚已获得美国药典（USP）和英国药典（BP）的认可，并在食品和制药行业得到广泛应用[3]。作为注射药物的载体，不同配方可实现数小时至数天的持续药物释放，从而在体内建立长效的疫苗递送机制。在本研究中，我们使用了聚氧乙烯醚P407和P188，并添加了羟丙基甲基纤维素（HPMC）以增强凝胶强度和黏膜粘附性，用于递送CPV-2c类病毒颗粒（VLPs）。

犬细小病毒（CPV）感染是一种高度传染性的全球性犬类疾病，是导致幼犬死亡的主要原因[4]。疫苗接种仍然是最有效的预防措施，但目前可用的CPV疫苗主要是基于CPV-2的减毒活疫苗，主要针对CPV-2a和CPV-2b变种。我们实验室在中国长江三角洲地区的最新流行病学监测发现，CPV-2c是主要流行的病毒株[5]。这种亚型具有强致病性，已成为感染接种过疫苗的犬只和成年犬的主要病原体。CPV的高突变率可能显著促进了病毒的持续、不受控制的传播[6]。值得注意的是，曾在感染犬只和接种疫苗犬只的粪便样本中检测到疫苗株病毒[7]，这提示可能存在病毒毒力恢复或野生动物传播的风险，因此迫切需要开发新型疫苗。

VP2结构蛋白是CPV的主要保护性抗原，约占病毒衣壳蛋白的90%，在病毒致病性和毒力中起关键作用[8]。以VP2为骨架制备的VLPs保留了真实病毒颗粒的天然构象表位，同时实现高密度抗原呈现。这些VLPs不仅保持了CPV的免疫原性，还能通过与细胞表面转铁蛋白受体的特异性结合，模拟自然感染途径，实现靶向递送[9]。与仅呈现有限表位的亚单位疫苗相比，基于VP2的VLPs能引发更强烈和持久的免疫反应。此外，与传统的减毒疫苗不同，VLPs不含病毒遗传物质，消除了疫苗脱落、毒力恢复或环境传播的风险，是一种更安全的疫苗选择[10]。

在本研究中，我们使用大肠杆菌原核表达系统表达了CPV-2c株的VP2蛋白，然后将其自组装成具有类似天然病毒颗粒结构的空心类病毒颗粒（VLPs）。随后，将这些VLPs加入基于聚氧乙烯醚的热敏水凝胶中，开发出了一种新型疫苗配方。系统评估了这种CPV-2c VLPs疫苗的安全性和免疫效果。我们的研究结果为下一代CPV疫苗的开发以及热敏水凝胶递送系统在兽医疫苗学中的应用提供了基础证据。

材料

聚氧乙烯醚407（P407，商品编号MB1968）和聚氧乙烯醚188（P188，商品编号MB1967）购自中国大连的美仑生物有限公司（Meilunbio Co., Ltd.）。羟丙基甲基纤维素（HPMC，分子量86,000 Da，粘度4000 cP）购自中国上海的RAWN有限公司（RHAWN Co., Ltd.）。BL21（DE3）化学感受态细胞（商品编号WD0102）购自上海伟迪生物技术有限公司（Shanghai Weidi Biotechnology Co., Ltd.）。重组大肠杆菌 BL21（DE3）-pET28a-VP2-2c表达株JSLYG-18（MW017574）和FK81猫病毒株也用于实验。

配方优化

测定了17种配方的T_m和G_t值，结果见表3。

使用Design Expert 10.0.1软件进行了统计分析，建立了T_m与三个配方因素（A：P407，B：P188，C：HPMC）之间的二次多项式回归模型。得到的回归方程为：

T_m = 36.8 - 5A + 4.5B + 0.5C - 0.5AB - 1.65A² - 1.65B² - 0.15C²（R² = 0.9078，P < 0.0001）。

该模型具有统计学意义（P < 0.0001），证实了变量之间的非随机关系

讨论

热敏水凝胶的温度响应性相变特性使其在疫苗和药物递送领域具有独特优势。在较低温度下，它们呈水相液态，作为良好的溶剂，有助于疫苗和药物的溶解，便于给药。随着温度升高，它们在给药部位迅速发生非化学交联，从水相转变为半固态凝胶

作者贡献声明

费莫（Fei Mo）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿撰写，资金获取，数据分析。钱静（Jing Qian）：资源提供，实验研究。唐叶平（Yeping Tan）：项目监督，项目管理。毕振伟（Zhenwei Bi）：项目监督。欧阳伟（Wei Ouyang）：撰写 – 审稿与编辑。王永山（Yongshan Wang）：资源提供，概念构思。江山香（Shanxiang Jiang）：方法学设计，概念构思。

致谢

本工作得到了江苏省农业科技创新基金（CX(22)3024）的支持。