利用低浓度对甲苯磺酸和木聚糖酶通过两步水解法从甘蔗渣中制备高纯度的木寡糖

《Biomass and Bioenergy》：Production of high-purity xylo-oligosaccharides from sugarcane bagasse by two-step hydrolysis using low-concentration p-toluenesulfonic acid and xylanase

木聚糖寡糖（XOS）制备工艺优化研究，采用对甲苯磺酸（p-TsOH）预处理甘蔗渣结合酶水解，通过单因素实验确定0.3% p-TsOH、150℃、45min预处理条件，XOS产率达47.7%，酶解后X2和X3占比67.4%，经活性炭吸附、水洗及乙醇萃取纯化后，纯度达91.01%，回收率80.9%。

　　

李志立|刘宇伟|张超勤|郝俊杰|陈雪芳|郭海军|张海荣|熊连|李海龙|陈新德

广西大学化学与化学工程学院，广西石化资源加工与过程强化技术重点实验室，中国南宁市，530004

摘要

木寡糖（XOS）因其功能性益生元活性和广泛的应用潜力而受到广泛关注。传统的稀酸预处理方法通常采用一步水解法生产XOS，这种方法往往需要较高的反应温度和较长的时间，并且容易产生聚合度（DP）较高的产品。使用对甲苯磺酸（p-TsOH）作为强有机酸可以提供一种有效的预处理方法，该方法能够降低反应的剧烈程度，更好地保持纤维素的完整性，并便于酸的回收。在本研究中，以甘蔗渣（SCB）为原料，开发了一种两步水解工艺，结合了低浓度p-TsOH预处理和木聚糖酶酶促水解，以生产高纯度的XOS。首先通过单因素实验确定了p-TsOH预处理的最佳条件：酸浓度0.3%，温度150°C，时间45分钟，产率为47.7%，且未产生抑制剂。随后使用木聚糖酶（40 IU/mL）进行水解，使XOS产物中木二糖（X₂）和木三糖（X₃）的比例从24.1%增加到67.4%。进一步通过16%活性炭吸附去除杂质、水洗以及乙醇洗脱，获得了80.9%的XOS回收率和91.01%的纯度，其中X₂和X₃的比例达到76.4%。产品的结构通过质谱和核磁共振光谱得到确认。这一工艺为甘蔗渣的增值利用和生产高纯度XOS提供了一种新策略。

引言

化石燃料储量的减少和日益严重的环境问题引起了全球对木质纤维素生物质高效转化和利用的关注[1]。因此，从传统的石油精炼厂向生物精炼厂的转变正在增加，生物精炼厂利用生物质的三大主要成分——纤维素、半纤维素和木质素——来生产燃料、食品和其他增值材料[2]。甘蔗渣（SCB）是一种丰富且重要的生物质资源，其结构主要由纤维素、木质素和半纤维素组成[3]。作为糖业的主要副产品，大量的SCB通常被丢弃或焚烧，这不利于其高价值利用。合理利用这些成分对于建立绿色、循环和可持续的经济至关重要[4]。值得注意的是，将半纤维素转化为高附加值的木寡糖（XOS）可以显著提高生物精炼厂的总体经济可行性[5]。根据市场数据，XOS的价格在每吨25,000至50,000美元之间，预计到2030年全球寡糖销售额将达到16.4亿美元[6]。这些经济前景近年来在科学界引起了广泛的兴趣。

传统上，XOS是通过从木质纤维素生物质中提取木聚糖，然后进行木聚糖酶水解来生产的[7]。这种方法具有XOS纯度较高和副产物生成较少的优点。然而，使用高浓度的碱剂会导致设备腐蚀并造成环境污染[8]。相比之下，对木质纤维素材料进行预处理以生产XOS被认为更加环保和成本效益更高，因为它涉及较少的处理步骤和较少的化学物质使用。目前，有机酸已被证明是实现高XOS产量的有效催化剂，同时可以最小化木糖的生成[9]。因此，最近的研究集中在使用温和的稀有机酸进行预处理，以提高工艺的可持续性，通常使用弱有机酸如醋酸和柠檬酸[[10],[11],[12]]。一步稀有机酸水解是一种简单、高效且高产量的方法，用于从木质纤维素生物质中生产XOS。杨等人通过结合2%乳酸预处理和木聚糖酶水解，从玉米芯中获得了69.9%的XOS产量[13]。曾等人使用3.56%的柠檬酸在135.7°C下处理大豆壳46.1分钟，获得了22.36%的XOS产量[14]；谢等人也在170°C下使用4%醋酸处理杨木40分钟，获得了50.28%的XOS产量[15]。然而，这些弱酸仍然存在缺点，如酸浓度高和回收困难。为了降低成本和提高XOS的提取率，寻找一种更强且温和的有机酸更为合适[16]。对甲苯磺酸（p-TsOH）是一种强有机酸，没有氧化性，可溶于热水而不溶于冷水，性质稳定[17]。此外，p-TsOH已被证明可以通过简单的方法回收，有效降低成本和减少环境污染。由于其有效的木质素溶解能力和环保性，它受到了广泛关注[18]。据报道，p-TsOH不仅能够通过分子与木质素苯环的相互作用减弱木质素的凝结，还能简单断裂木质素-碳水化合物键而不降解碳水化合物[19]。因此，一项研究使用0.5%的p-TsOH在160°C下热处理杨木40分钟，获得了49.8%的XOS产量，残余滤液中的木质素凝结非常少，显示出优异的抗氧化性能[20]，有效地利用木质素对于提高生物精炼厂的总体可持续性和经济可行性至关重要。尽管其他有机酸也能获得类似的XOS产量，但大多数方法无法保护木质素的完整性。

虽然直接稀酸水解可以获得更好的XOS产量，但一步酸水解得到的XOS的聚合度（DP）往往较高，其中木二糖（X₂）和木三糖（X₃）是XOS中最有效的成分，这导致经济效益较低[21]。作为益生元，与其他高DP成分相比，它们在促进人类营养和健康方面发挥着更积极的作用[22]。因此，通过进一步水解增加XOS中X₂和X₃的比例可以提高XOS的价值[23]。因此，通过热处理和木聚糖酶水解预处理的寡糖进行了研究，这种组合策略产生了44.6%的XOS产量，其中X₂和X₃的比例为78.7%[24]。然而，使用低浓度p-TsOH和木聚糖酶进行两步水解来制备富含X₂和X₃的XOS的研究尚未开展[25]。

为了获得高纯度的X₂和X₃，应使用合适且简单的分离方法。目前使用膜分离和色谱技术来纯化XOS，但这些方法成本较高，不适合大规模应用[26]。电渗析和液-液萃取常用于从水解物中分离和纯化酸，但这些方法导致酸的回收率有限且成本较高[27,28]。在这种情况下，开发具有高效率、节能和低毒性的其他分离和纯化方法对于生产高纯度的理想XOS（特别是X₂和X₃）至关重要。最近有报道使用活性炭-乙醇水混合物纯化高纯度的X₂[29]，但从成分复杂的SCB水解物中分离和纯化X₂和X₃的方法尚未报道。

在本研究中，使用p-TsOH预处理SCB，然后结合木聚糖酶的两步水解来增加X₂和X₃的比例。本研究系统地研究了p-TsOH浓度、预处理反应时间和温度对XOS和抑制剂生成的影响。此外，还优化了木聚糖酶水解的条件，最终使用活性炭和乙醇-水混合物分离产物，获得了高纯度的XOS。该研究为从LCB中控制和高效生产高纯度XOS提供了一种有前景的策略，为生物精炼工艺的优化提供了重要的见解。

材料

SCB购自中国广西壮族自治区。将甘蔗渣干燥后用粉碎机磨成粉末，然后筛分得到粒径小于0.25毫米（60目）的样品。对甲苯磺酸（p-TsOH·H₂O，纯度99.0%）购自上海Macklin生化科技有限公司。醋酸、H₂SO₄（98%）和三水合醋酸钠购自天津大茂化学试剂厂。商业木聚糖（纯度95.0%）购自Macklin工业集团

p-TsOH预处理对XOS产量的影响

XOS的产量受多种工艺参数的影响，如酸浓度、反应温度和水解时间[32]。本研究中的预处理优化采用了单因素实验策略，重点研究了p-TsOH浓度、温度和时间对XOS产量的独立影响。首先研究了不同浓度的p-TsOH在不同温度下对XOS产量的影响。如图1所示，随着酸浓度的增加

结论

本研究利用低浓度的p-TsOH预处理SCB以生产XOS。预处理过程选择性地将半纤维素降解为XOS，经过木聚糖酶水解后，X₂和X₃的比例增加。最佳条件确定为0.3% p-TsOH、150°C和45分钟的反应时间，产率为47.7%，水解后X₂和X₃的比例达到67.4%。分离和纯化后，纯度为91.01%，回收率为80.9%

CRediT作者贡献声明

李志立：撰写——初稿，研究，数据分析。刘宇伟：撰写——初稿，方法学，研究，数据分析。张超勤：撰写——审阅与编辑，研究。郝俊杰：撰写——审阅与编辑，研究。陈雪芳：撰写——审阅与编辑，研究。郭海军：撰写——审阅与编辑。张海荣：撰写——审阅与编辑。熊连：撰写——审阅与编辑。李海龙：撰写——

致谢

本工作得到了江苏省科学技术项目（BE2023324）和广东省基础与应用基础研究基金（2024A1515030099）的支持。