通过隧道阻断工程提高UDP-糖基转移酶的区域选择性，以实现icariside D2的专一合成

《Bioorganic Chemistry》：Regioselectivity enhancement of UDP-glycosyltransferase via tunnel-block engineering for the exclusive synthesis of icariside D2

糖基转移酶UGT_BL1通过阻断活性口袋附近的tunnel X，选择性提升icariside D2合成至99%，同时提高酶活性1.8倍，解决了区域选择性与催化活性间的权衡问题，并成功应用于Bacillus subtilis的UGT。

　　

肖凯峰|赵丽婷|段佩琴|马忠宝|徐梦梦|陈雷|史贵阳|丁忠阳

江南大学生物技术学院，教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，中国无锡214122

摘要

糖基化是天然产物中常见的修饰方式，能够提升其药理价值。Icariside D2是由酪醇的O-糖基化衍生而来，具有显著的抗肿瘤和心血管保护作用；然而，其生物合成受到UDP-糖基转移酶（UGT）区域选择性的限制，导致Icariside D2和Salidroside的混合物产生。通过靶向来自Bacillus licheniformis ZSP01的UGT_BL1，我们发现活性口袋中靠近亲核组氨酸处有一个通道（通道X），该通道对底物进入或产物释放并非必需，但能有效控制区域选择性。阻断通道X后，Icariside D2的合成实现了区域选择性，酶活性比野生型提高了1.8倍，从而克服了区域选择性与酶活性之间的权衡。区域选择性和结构分析表明，阻断通道X会阻碍酪醇中醇羟基的去质子化，进而抑制Salidroside的合成。值得注意的是，对于Icariside D2的合成，葡萄糖基化仍更倾向于酚羟基。这种通道阻断策略也被应用于来自Bacillus subtilis 168的UGTBSYjiC，获得了BS-A13E和BS-A13H突变体，它们对酪醇酚羟基的区域选择性分别提高了77.2%和78.7%。本研究为Icariside D2的专一高效生物合成提供了理论基础，并对UGT的区域选择性修饰机制提供了见解。

引言

糖基化可以显著提高天然产物的水溶性、药理活性和生物利用度，从而增强其药用价值[1]。酚类糖苷具有广泛的生物活性，在药物开发、功能性食品和化妆品领域有广泛应用[2],[3]。Icariside D2是一种由对羟基苯乙醇（酪醇）衍生的酚类糖苷，具有多种生物活性，包括抗肿瘤、抗高血压和抗心肌缺血作用[4],[5]。Icariside D2主要从Nelumbo、Ficus和Tinospora等植物中提取[6],[7],[8]。与这种资源密集型的方法相比，酶法合成是一种更环保、更温和的替代方案，具有更简单的工艺和更少的副反应，显示出生产这类天然产物的巨大潜力[9],[10],[11]。

糖基转移酶（EC 2.4.x.y）负责将糖基从供体转移到各种生物分子上，其中UDP-糖基转移酶（UGTs）是多种天然糖苷生物合成的主要酶[12]。来自Bacillus的UGTs已被广泛用于高效催化Icariside D2的合成；然而，由于UGTs普遍存在区域选择性差的问题，同时也会生成Salidroside（Icariside D2的区域异构体）[13]。尽管UGTs的低区域选择性在合成多种糖苷时具有便利性[14],[15],[16]，但它限制了特定糖苷的合成，从而影响了潜在的商业化产量。此外，Icariside D2和Salidroside是通过酪醇的不同羟基进行糖基化形成的。而且，分离和纯化这两种结构相似的产物仍然具有挑战性。尽管使用色谱法可以理想地分离Icariside D2和Salidroside，但在工业规模上这种方法并不经济[17]，提高UGTs在Icariside D2和Salidroside大规模生产中的催化选择性仍然是一个挑战。

合理设计和定向进化已成为精确调控生物催化中酶区域选择性的首选策略[18],[19]。近年来，人们一直在努力提高UGT对酪醇各羟基的区域选择性。通过对Bacillus licheniformis ATCC 14580的BLYjiC进行通道工程改造，其对酪醇酚羟基的区域选择性从51.2%提高到了99.2%；然而，酶活性下降到了野生型的72.8%[20]。对于Bacillus licheniformis ZSP01的UGT_BL1，通过减小UGT_BL1腔体A的表面积，其对酚羟基的区域选择性提高到了99%，但催化活性降至野生型的20%；后续优化使酶活性相比原始化合物提高了175%[21]。尽管UGT_BL1的定向进化产生了对Icariside D2合成活性提高270%的多位点突变体，但其对酚羟基的区域选择性仍仅限于77.8%[22]。与Icariside D2相比，一种高度选择性的Salidroside合成突变体在对醇羟基的区域选择性上达到了99%，相对活性提高了690%[21]。因此，与醇羟基的糖基化不同，提高UGT对酪醇酚羟基的区域选择性通常会降低酶活性。因此，需要更深入地理解UGT对酪醇的区域选择性，以实现酚羟基糖基化的优先选择，同时克服固有的区域选择性-活性权衡。

在这项研究中，我们改造了具有相对较高催化活性的UGT_BL1，以提高其对Icariside D2的区域选择性。通过阻断靠近亲核组氨酸处的通道，实现了对酪醇酚羟基的专一区域选择性，酶活性普遍得到提升。底物结合分析表明，通道阻断使醇羟基的催化路径发生改变，从而抑制了Salidroside的合成，同时保持了Icariside D2的合成。我们提出的通道阻断策略在工程化其他来源的区域选择性糖基转移酶方面显示出巨大潜力。这些结果为提高Icariside D2的生产效率和选择性提供了理论基础。

材料与方法

质粒、菌株和化学品

Salidroside、尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）和酪醇购自Yuanye Biotechnology Co., Ltd.（中国上海）。Icariside D2购自BioBioPha Co. Ltd.（中国昆明）。所有其他试剂均购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）和Macklin, Inc.（中国上海）。

UGT_BL1（来自Bacillus licheniformis菌株ZSP01）（GenBank登录号：KP123426.1）由Sangon（中国上海）合成。糖基转移酶BSYjiC

通过丙氨酸扫描和虚拟饱和突变筛选出的突变体

基于丙氨酸筛选和虚拟饱和突变实验，选择了13个突变体（L232A/I/Q、A235Y/F/W/V/N和G299D/H/F/M/W）进行验证（图S2–S3）。涉及残基235的突变体表现出对酪醇酚羟基的区域选择性增强和相对活性提高（图1b）。具体来说，突变体A235N对酚羟基具有专一的区域选择性，其酶活性为124.6%。

讨论

多用途的UGTs难以在具有多个糖基化位点的受体上选择特定的催化位点，这不利于产物的纯化和分离，也限制了目标产物的合成效率[16]。先前，虽然通过改造UGT使其对酪醇酚羟基具有高区域选择性，但会导致酶活性下降[20],[21],[22]。尽管可以通过进一步修饰来提高酶活性，但结合多个突变仍然存在挑战

结论

我们发现UGT_BL1中靠近亲核残基的一个通道（通道X）在改变UGT对酪醇酚羟基的区域选择性方面起着重要作用。阻断通道X产生了一系列仅能从酪醇合成Icariside D2的突变体，并使相对酶活性提高了179%。在野生型中，通道X允许H16对醇羟基进行亲核攻击形成Salidroside；而人工阻断该通道后

CRediT作者贡献声明

肖凯峰：撰写——原始草稿、软件开发、方法学设计、实验实施、数据整理、概念构思。赵丽婷：撰写——审稿与编辑、监督、方法学设计、资金争取、概念构思。段佩琴：软件开发、方法学设计、实验实施。马忠宝：方法学设计、数据分析。徐梦梦：监督、方法学设计。陈雷：监督、方法学设计。史贵阳：监督、资源协调。丁忠阳：监督、资金争取、概念构思。

资助

本研究得到了国家轻工业技术与工程一流学科计划（LITE2018–22）、中国博士后科学基金会（2024M751159）和江苏省优秀博士后人才资助计划（2024ZB600）的支持。

未引用参考文献

[29]

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究中分子动力学模拟和结构分析得到了江南大学生物技术学院高性能计算集群平台的支持（中国无锡）。