《Bioresource Technology》：High-efficiency enzymatic conversion of cellulose to starch by strengthening glucose-utilization bypass
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人工淀粉从非食品纤维素生物质中体外合成通过构建葡萄糖利用旁路（PPGK-PGM）并设计PGM-PGP融合复合体，将理论淀粉产量提升至100%，实际产量达68.2%，较原途径提高22.4%。
张圆圆|陈梦龙|王亚婷|熊振伟|徐克强|刘新宇|林辉|刘全军|陈洪革
河南农业大学生命科学学院，郑州450046，中国
摘要
从非食品纤维素生物质中体外合成人工淀粉是一种可持续的策略，有助于农业废弃物的利用和缓解食物短缺问题。然而，先前建立的体外纤维素到淀粉的转化途径存在根本性限制，因为纤维素中的葡萄糖单元只有大约一半能够被整合到直链淀粉中，导致理论上的直链淀粉产量仅为50%。在此，我们构建了一个葡萄糖利用旁路，包括多磷酸葡糖激酶（PP GK）和磷酸葡糖变位酶（PGM），将葡萄糖副产物重新导向直链淀粉的生物合成，从而将理论直链淀粉产量提高到100%。为了促进PGM催化的葡萄糖-6-磷酸向葡萄糖-1-磷酸的热力学不利转化，我们构建了三种PGM与下一步酶——马铃薯α-葡聚糖磷酸化酶（PGP）之间的双酶复合体。实验结果表明，PGM-PGP融合复合体对增强葡萄糖利用旁路具有最大的促进作用，使得一步法纤维素到淀粉的生物转化直链淀粉产量达到了68.2%，比单独使用PGM和PGP提高了22.4%。新建立的纤维素到淀粉途径2.0通过加强葡萄糖利用旁路，使淀粉生产效率提高了2.3倍，从而提高了纤维素生物质转化为淀粉的经济可行性。
引言
随着全球人口的持续增长和人均消费量的增加，对食物的需求也在迅速上升（Xu等人，2023年）。作为人类饮食的主要成分，淀粉主要来源于传统耕作系统下种植的粮食作物。鉴于地球上可耕地和淡水的有限性，来自生物反应器的合成淀粉备受青睐。2013年，张YHP建立了一种体外酶促途径，将纤维素转化为淀粉，实现了30.0%的直链淀粉产量（You等人，2013年）。这项工作为利用农业纤维素废弃物在生物反应器中生产淀粉提供了可能性，从而有可能解决全球粮食危机。
在这种纤维素到淀粉的途径中，纤维素首先在内葡聚糖酶（EG）和纤维二糖水解酶（CBH）的协同作用下被水解为纤维二糖，然后纤维二糖磷酸化酶（CBP，EC 2.4.1.20）催化纤维二糖的可逆磷酸解反应，生成葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）和葡萄糖。作为糖基供体的G-1-P随后被马铃薯α-葡聚糖磷酸化酶（PGP，EC 2.4.1.1）转移到麦芽糊精底物上，从而在不消耗ATP的情况下合成直链淀粉。这一途径在多个方面具有优势，如能够同时解决纤维素废弃物的再利用和食物供应问题，不消耗能量或易变辅酶，并且易于扩大生产规模。然而，由于其直链淀粉产量受到限制——因为纤维素中的葡萄糖单元只有大约一半能够被整合到直链淀粉中（纤维素完全水解为纤维二糖后），理论上的直链淀粉产量仅为50%。CBP和纤维素水解释放的葡萄糖不仅会导致葡萄糖单元的损失，还会抑制纤维素酶和CBP的活性，进一步阻碍纤维素向淀粉的转化过程。为了消除葡萄糖的抑制作用，人们引入了额外的处理方法，例如添加葡萄糖氧化酶来转化葡萄糖（You等人，2013年）或添加酵母来吸收葡萄糖（Xu等人，2023年）。显然，开发一种有效的策略将葡萄糖整合到直链淀粉链中对于提高纤维素到淀粉途径的直链淀粉产量至关重要。
体外葡萄糖磷酸化的最具成本效益的方法是通过多磷酸葡糖激酶（PP GK，EC 2.7.1.63）（Chen和Zhang，2021年），它使用低成本的无机多磷酸盐（polyP）作为磷酸供体来催化葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）的形成。因此，很容易构建一个由PP GK和磷酸葡糖变位酶（PGM，EC 5.4.2.2）组成的葡萄糖利用旁路，使葡萄糖能够转化为G-1-P并进入纤维素到淀粉的转化途径。图1展示了增强纤维素到淀粉转化的整体反应方案。通过引入葡萄糖利用旁路，纤维素到淀粉途径的理论直链淀粉产量可以达到100%。然而，该旁路中存在一个热力学上不利的反应：PGM催化的反应在标准条件下的平衡常数（Keq）为20，强烈倾向于生成G-6-P（标准吉布斯自由能变化ΔrG'° = –7.4?±?1.5?kJ/mol），从而无法从G-6-P充分供应G-1-P用于直链淀粉的合成。因此，我们提出构建PGM和PGP的双酶复合体，其中PGM生成的G-1-P可以直接被PGP捕获并迅速转移到正在生长的直链淀粉链中，实现两个活性位点之间的底物定向传输。在这种情况下，G-1-P的及时去除将促进PGM催化的反应持续生成G-1-P，从而加强葡萄糖利用旁路。
在本研究中，我们在纤维素到淀粉途径中构建了一个葡萄糖利用旁路，并设计了三种PGM和PGP之间的双酶复合体来增强该旁路的效果。实验表明，PGM和PGP的融合复合体对葡萄糖利用旁路的促进作用最强，将纤维素的直链淀粉产量提高了68.2%。这项工作显著提高了纤维素到淀粉的生物转化效率，为大规模生产合成直链淀粉奠定了基础。
化学品和试剂
所有化学品均购自中国上海的中药化学试剂有限公司和中国北京的SolarBio公司，除非另有说明。微晶纤维素Avicel PH-101和麦芽糊精（DE 4–7）购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich公司。商业纤维素酶Celluclast 1.5?L购自美国北卡罗来纳州弗兰克林顿的Novozymes North America公司。葡萄糖脱氢酶购自中国上海的Macklin Biochemical Technology有限公司。
葡萄糖利用旁路的构建及PGM和PGP之间双酶复合体的设计
在本研究中，我们在已建立的纤维素到淀粉途径中设计了一个葡萄糖利用旁路，希望通过将葡萄糖副产物转化为直链淀粉链的单元来提高直链淀粉产量。这个新途径可以称为纤维素到淀粉途径2.0（图2A）。在葡萄糖利用旁路中，葡萄糖依次被PP GK和PGM催化生成G-1-P，然后进入中央的纤维素到淀粉途径进行直链淀粉合成。
结论
本研究成功地在先前报道的纤维素到淀粉途径中构建了一个由PP GK和PGM组成的葡萄糖利用旁路，称为纤维素到淀粉途径2.0。通过构建三种不同的PGM和PGP双酶复合体，我们证明PGM-PGM复合体在增强旁路效果方面表现最佳，在一步法纤维素到淀粉系统中实现了68.2%的直链淀粉产量，比单独使用PGM提高了22.4%。
CRediT作者贡献声明
张圆圆：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学研究。陈梦龙：方法学研究。王亚婷：方法学研究。熊振伟：方法学研究。徐克强：方法学研究。刘新宇：方法学研究。林辉：方法学研究。刘全军：指导，方法学研究，概念设计。陈洪革：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，资金获取，概念设计。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了中国国家重点研发计划（项目编号2022YFC3401700）的财政支持。我们感谢巴基斯坦马尔丹阿卜杜勒·瓦利·汗大学农业系的Asad Ali教授对本文英文质量的改进工作。
