在Azotobacter vinelandii和大肠杆菌（Escherichia coli）的共培养体系中，通过苏氨酸合成促进氮固定

《Bioresource Technology》：Promoting nitrogen fixation by threonine synthesis in co-culture of Azotobacter vinelandii and Escherichia coli

氨基酸生物合成直接利用大气氮的研究新进展，构建氮 fixation-利用耦合系统通过工程化Azotobacter vinelandii和Escherichia coli共培养实现乙醇和N2向苏氨酸的定向转化。代谢工程优化包括抑制nifL-NifA调控系统提升固氮效率，设计高效NH4+转运和苏氨酸合成途径，使产物浓度提升3.4倍。

　　

王英晨|王彦音|孙文辉|曹旭鹏|李灿

中国科学院大连化学物理研究所催化国家重点实验室，中国大连国家清洁能源实验室，大连116023

摘要

直接从氮气（N₂）生产氨基酸是绿色生物制造中的一个重大挑战。将生物固氮（BNF）与目标氨基酸的生物合成结合在共培养系统中提供了一个有前景的解决方案。在这里，我们构建了一个氮固定-利用耦合（NFUC）系统，通过共培养工程改造的Azotobacter vinelandii进行固氮和大肠杆菌进行苏氨酸生物合成，实现了直接从N₂生产苏氨酸。通过优化NH₄⁺的释放、苏氨酸代谢途径和能量供应，系统的代谢工程使苏氨酸的产量比初始共培养提高了3.4倍。Azotobacter vinelandii的固氮活性在共培养中因苏氨酸合成的需求而增强，从而提高了总固定氮的量。共培养的Azotobacter vinelandii中谷氨酰胺合成酶活性的下调表明其优先固定氮气而非内源性氨基酸的合成，这增加了大肠杆菌可利用的NH₄⁺水平。该NFUC系统为直接从N₂可持续生产氨基酸建立了平台。

引言

氮是生命的基本元素，然而其生物可利用的形式（如铵离子（NH₄⁺）在自然界中的存在量与生物需求严重不成比例（Canfield等人，2010年；Rees和Howard，2000年）。尽管分子氮（N₂）占地球大气的约78%，但其惰性的三键结构使其对大多数生物不可利用（Deng等人，2018年）。因此，生物固氮（BNF），即由固氮酶催化的N₂还原为NH₄⁺的过程，对于合成生命必需的含氮化合物（包括氨基酸）至关重要（Kuypers等人，2018年）。氨基酸是蛋白质的构建块，在饲料添加剂、药品和化学试剂中有广泛的应用（Wu，2009年）。然而，直接从N₂生产氨基酸仍然是绿色生物制造中的一个重大挑战。

像Azotobacter vinelandii这样的固氮菌是BNF过程的天然催化剂（Smercina Darian等人，2019年）。然而，利用它们的BNF能力来生产目标氨基酸受到内源性调控网络的阻碍（Dixon和Kahn，2004年）。例如，NifL-NifA系统通过感知细胞内的能量、碳和氮状态来严格调控固氮过程（Boyer等人，2023年；Leigh和Dodsworth，2007年；Zhang等人，2024年）。在存在优先氮源的情况下，固氮酶的表达受到转录水平的调控，导致细胞外氮的释放量很少（González-López等人，1995年；Smercina Darian等人，2022年）。合成生物学策略，如删除铵转运基因amtB（Barney Brett等人，2015年）、部分破坏谷氨酰胺合成酶（Ortiz-Marquez等人，2014年）以及抑制NifL-NifA等调控网络（Bali等人，1992年；Ortiz-Marquez等人，2012年），提高了细胞外NH₄⁺的产量。然而，这些方法主要改善了NH₄⁺的释放，但不能促进特定氨基酸的合成。生产目标氨基酸需要碳源来提供前体形成的碳骨架（Wu，2009年），以及大量的还原能力和ATP来驱动N₂的固定和氨基酸的生物合成（Fourmond和Leger，2017年）。然而，由于非模式固氮菌缺乏成熟的遗传工具，平衡这种碳流和能量供应的代谢工程面临限制（Mahmud等人，2020年）。另一种策略是将固氮酶引入强大的工业宿主菌株中，如大肠杆菌（E. coli），这种菌株用于氨基酸生产但缺乏固氮酶（Leuchtenberger等人，2005年；Vo等人，2024年）。虽然已经在E. coli中表达固氮酶基因方面取得了显著进展（Solomon等人，2024年；Xiang等人，2020年），但实现功能性表达仍然具有挑战性。固氮酶组装的复杂性使得异源重组变得困难（Burén等人，2020年），导致工程菌株中的表达和活性较低（Solomon等人，2024年）。

共培养系统为将BNF与氨基酸生产结合起来提供了一个有前景的解决方案，将固氮菌与异养生产者配对（Cestellos-Blanco等人，2022年；Pan等人，2023年）。例如，Azospirillum物种与Bacillus subtilis共培养时，由于Bacillus subtilis能够有效降解果胶，为Azospirillum提供碳和能量，从而增强了固氮作用并增加了生物量（Khammas和Kaiser，1992年）。此外，Rhodopseudomonas palustris与非N₂固定菌共培养也通过减轻氧化应激恢复了固氮酶活性（Arashida等人，2019年）。然而，这些系统主要集中在优化代谢物交换和氧气保护上（Leroux等人，2024年；Zhang等人，2022b）。共培养系统直接从N₂生产目标氨基酸的潜力尚未被探索。

在这里，我们通过将工程改造的A. vinelandii与大肠杆菌（E. coli）模块化整合，构建了一个氮固定-利用耦合（NFUC）系统，用于从N₂合成苏氨酸。我们通过¹⁵N₂标记实验确认NFUC系统实现了直接从N₂生产苏氨酸。通过删除A. vinelandii中的负调控基因nifL并在E. coli中过表达苏氨酸生物合成和输出基因，系统的代谢工程使苏氨酸的产量比初始共培养提高了3.4倍。此外，苏氨酸的合成加速了N₂的固定，这体现在总固定氮和细胞外NH₄⁺水平的增加上，与A. vinelandii单培养相比。

实验条件

培养条件

本实验使用了Luria-Bertani（LB）培养基、K3培养基、Burk培养基和PB培养基。Luria-Bertani（LB）培养基（每升含）10克色氨酸、5克酵母提取物和10克NaCl，用于质粒和大肠杆菌（E. coli）菌株的构建。K3培养基（pH 7.0）（每升含）13.3克KH₂PO₄、4克（NH₄)₂HPO₄、1.2克MgSO₄以及微量元素（0.0084克EDTA、0.0025克CoCl₂、0.015克MnCl₂、0.0015克CuCl₂、0.003克H₃BO₃、0.0025克Na₂MoO₄、0.008克Zn(CH₃COO)₂、0.06克Fe(III)

工程改造A. vinelandii的固氮能力和E. coli的苏氨酸合成

为了通过A. vinelandii和E. coli的共培养构建氮固定-利用耦合（NFUC）系统，我们首先改造A. vinelandii使其释放NH₄⁺，并改造E. coli使其生产苏氨酸。A. vinelandii中的固氮酶将每个N₂分子还原为NH₄⁺至少需要8个电子和16个ATP（Fourmond和Leger，2017年），这些可以通过乙醇转化为乙酰-CoA及其在TCA循环中的氧化来提供。同时，一个

结论

本研究构建了氮固定-利用耦合（NFUC）系统，用于直接从N₂和乙醇生产苏氨酸。¹⁵N₂标记证实苏氨酸是直接从N₂合成的。为了提高苏氨酸的产量，我们通过抑制调控NifL-NifA系统改造了A. vinelandii，并设计了E. coli以高效利用细胞外的NH₄⁺进行苏氨酸生物合成。通过增强固氮作用并降低谷氨酰胺合成酶的活性，

CRediT作者贡献声明

王英晨：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、数据整理。王彦音：撰写——审稿与编辑、验证、资金获取。孙文辉：撰写——审稿与编辑。曹旭鹏：撰写——审稿与编辑。李灿：撰写——审稿与编辑、监督、资源获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作在人工光合作用基础研究中心（FReCAP）进行，得到了国家自然科学基金（编号22088102）的财政支持。感谢玉林大学与大连国家清洁能源实验室联合基金（编号2023003）和DICP&SIA联合基金（编号DICP&SIA UN202402）的资助。同时感谢大连化学物理研究所能源研究资源部门对LC-MS分析的支持。