《Bioresource Technology》：Engineering
Escherichia coli cell Factories for continuous 5′-cytidine monophosphate production via biofilm-anchored dual-enzyme cascade catalysis
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连续5'-CMP生产系统通过CRISPR-Cas9整合pgaABCD基因簇增强生物膜形成能力，并采用冰核蛋白与自转运蛋白双锚定策略表面展示尿苷激酶和丙酮酸羧化酶，构建细胞-酶共固定化生物催化平台。该系统实现1.77 mmol/L/h的5'-CMP产量，较游离酶催化效率提升5.98倍，连续循环10次后仍保持73.79%的底物转化率和59.26%的产物收率。分隔符：
孙文军|朱诗雅|董启伟|唐淑燕|刘庆国|沙宇|陈天鹏|王瑞|陈勇|应汉杰
中国南京工业大学生物技术与制药工程学院国家生物技术工程研究中心，南京211816
摘要
5′-胞苷一磷酸（5′-CMP）是多种核苷酸衍生物的关键中间体，在食品和制药行业中具有广泛的应用。然而，现有的酶法生产过程存在催化效率低和经济效益差的问题。在这项研究中，我们开发了一种基于细胞-酶共固定生物催化平台的连续5′-CMP生产系统。首先，利用CRISPR-Cas9将pgaABCD基因簇整合到ClearColi BL21(DE3)中，使其生物膜形成能力提高了168.93%，并实现了细胞在载体上的牢固固定。其次，通过使用冰核蛋白（INP）和自动转运蛋白（AIDA-I）的双重锚定策略，实现了尿苷激酶（UDK）和乙酸激酶（AckA）在细胞表面的展示。这种方法通过生物膜工程成功解决了游离酶的不稳定性和回收问题。改造后的菌株5′-CMP的生产速率达到了1.77 mmol/L/h，比游离细胞内酶催化效率高5.98倍，并且在测试条件下可连续使用十次，同时保持胞苷转化率超过73.79%，5′-CMP产量超过59.26%。这项工作首次实现了连续5′-CMP的生物合成，为工业生产建立了一条高效途径。
引言
5′-胞苷一磷酸（5′-CMP）是一种高价值的核苷酸，由于其营养和调节功能，在食品（Lee和Kim 2006）、制药（Hawkes等人，2006）和农业行业中得到广泛应用（Qian等人，2014）。对核苷酸衍生生物活性化合物的需求不断增加，凸显了开发可扩展和可持续的5′-CMP生产策略的必要性。目前，5′-CMP主要通过RNA水解（Deoda和Singhal 2003）、化学合成（Yoshikawa和Kato 2006）或酶促磷酸化（Bülter和Elling 1999）来生产。其中，RNA水解和化学合成存在明显缺点，无法满足大规模、高纯度生产的要求。而利用微生物系统的酶促生物合成作为一种有前景的替代方法，具有温和的反应条件、高选择性和工艺强化的潜力（Li等人，2020）。通常，胞苷（Cyt）通过尿苷-胞苷激酶（UDK）（Liu等人，2022）转化为5′-CMP，该酶将γ-磷酸从ATP转移到Cyt的5′-羟基上（Van Rompay等人，2001）。然而，ATP的消耗量大且成本高，严重限制了这种方法的可扩展性（L?ffler等人，2016；Schuhmacher等人，2014）。为了解决这个问题，人们将ATP再生系统（如乙酰磷酸（AcP）（Whicher等人，2018）、多磷酸（polyP）（Nocek等人，2008）或磷酸烯醇式丙酮酸（PEP））与激酶结合，以实现循环利用（Crans等人，1987）。尽管取得了这些进展，但目前大多数系统仍依赖于游离酶，这些酶存在不稳定性、回收困难以及操作寿命短的问题，阻碍了其工业应用（Thapa等人，2019）。
为了解决这些问题，人们采用了酶固定技术来提高稳定性和重复使用性（Chapman等人，2018；Qian等人，2014；Zhou等人，2023）。其中，微生物细胞表面展示通过将催化蛋白与外膜蛋白（如Omp1）、冰核蛋白（INP）或自动转运蛋白（如AIDA-I）融合，提供了一个简化的酶固定平台，实现了整个细胞的催化作用，同时避免了酶的纯化步骤（Liu等人，2025）。大肠杆菌是一种常用的宿主，因为它具有遗传特性明确、生长迅速且易于操作（Yu等人，2021）。然而，尽管酶的定位和活性得到了改善，但由于环境压力或细胞老化，表面展示的酶在长时间操作过程中仍可能表现下降（Reetz，2013）。
为了进一步提高催化剂的稳定性和操作寿命，基于生物膜的固定技术受到了越来越多的关注（Liang等人，2020；Niu等人，2025）。生物膜由细胞外聚合物物质（EPS）组成，包括纤维素和聚-β-1,6-N-乙酰葡糖胺（PGA）等多糖，这些物质提供了机械强度、增强的表面粘附性和对环境变化的保护（Vu等人，2009）。在ClearColi BL21(DE3)（以下简称CC）中，PGA的生物合成由pgaABCD操纵子调控（Wang等人，2004），而调节蛋白如Ag43（Kj?rgaard等人，2000）和CsgD（Yan等人，2023）有助于粘附和基质形成。这些特性可以用来稳定生物膜形成细胞在固体支持物上的生长，提供一个坚固且可再生的生物催化平台。
在这项研究中，我们开发了一种结合细胞表面展示和基于生物膜固定的双酶级联系统，用于连续的、ATP再生的5′-CMP生物合成。具体来说，通过使用冰核蛋白和自动转运蛋白的双重锚定策略，将UDK和AckA共展示在CC的外膜上。同时，CRISPR-Cas9介导的pgaABCD操纵子整合显著增强了CC的生物膜形成能力，使细胞牢固地粘附在载体上，并实现了酶的间接固定。由此形成的生物膜锚定的细胞-酶共固定系统有效地建立了表面级联催化微环境，同时保护了细胞和酶免受失活。引入的原位ATP再生机制进一步提高了能源效率并降低了成本。这种集成策略不仅避免了游离酶系统的局限性，还实现了稳定的10批次连续转化过程，底物转化率始终超过74%，生产速率比游离酶催化高5.98倍。我们的结果表明，膜锚定的、生物膜固定的CC细胞是一种高效的工业5′-CMP生物催化微工厂，为可持续的核苷酸生物合成提供了新的范例。
菌株和培养基
原始菌株ClearColi BL21(DE3)购自Lucigen Corporation（表S1）。所有克隆均按照分子克隆的标准协议进行，并通过DNA测序进行了验证。本研究中使用的菌株和质粒列于表S1中。CC细胞常规在Luria-Bertani（LB）培养基（1%色氨酸，0.5%酵母提取物，1% NaCl）（Sezonov等人，2007）中培养，并添加了适当的抗生素（卡那霉素或氨苄西林，100 μg/mL）。
重组质粒和工程菌株的构建
设计了引物
生物膜增强菌株的构建和验证
为了为下游的表面展示和固定级联催化提供稳定的基础，我们首先增强了CC的生物膜形成能力。通过质粒过表达筛选，发现pgaABCD是最有效的模块：与野生型相比，csgD和pgaABCD过表达菌株的生物膜生物量分别增加了79.58%和219.86%（图1A）。基于这一结果，并为了防止Cyt的无谓脱氨，选择了相应的基因位点进行整合
结论
本研究通过结合生物膜增强的CC菌株与表面展示的UDK和AckA，展示了一种实用的连续5′-CMP生产方法。染色体pgaABCD的整合增强了粘附性，且没有明显的生长抑制，从而实现了稳定的载体保持。优化的UDK展示和AckA锚定，以及比例调整，使得单次批次的性能非常高（1小时内Cyt转化率为99.15%，5′-CMP产量为84.14%）。将这些设置应用于共固定操作中
CRediT作者贡献声明
孙文军：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，方法学，研究，形式分析，概念化。朱诗雅：撰写 – 审稿与编辑，验证。董启伟：方法学，概念化。唐淑燕：方法学，概念化。刘庆国：验证，方法学，研究，形式分析，数据管理。沙宇：撰写 – 审稿与编辑，验证。陈天鹏：监督，概念化。王瑞：撰写 – 审稿与
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划（2022YFC2105400）、国家自然科学基金（22178176；22208157）、江苏省自然科学基金（BK20253004）、江苏先进生物制造协同创新中心（XTA2201）、材料导向化学工程国家重点实验室（SKL-MCE-22A04）、江苏合成生物学基础研究中心（BK20233003）的支持。
