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α-KG通过激活LKB1-AMPK信号轴改善炎症诱导的HPDLSCs线粒体功能障碍和衰老，促进牙周再生。实验显示α-KG逆转LPS诱导的HPDLSCs线粒体膜电位下降、ROS累积及衰老表型，其机制涉及AMPK信号增强和LKB1表达恢复。动物模型证实口服α-KG有效抑制牙槽骨吸收并促进再生。
张欣|李凌霜|刘宏瑞|张耀光|吴永伟|孙长云|郭杰|李敏琦
山东大学齐鲁医学院口腔学院及附属医院正畸科；美国口腔组织再生山东省重点实验室；牙科材料与口腔组织再生山东省工程研究中心；山东省口腔疾病临床研究中心
摘要
牙周炎是一种慢性炎症性疾病，其特征是持续的炎症会诱导人类牙周韧带干细胞（HPDLSCs）的衰老和功能受损，从而阻碍牙周组织的再生。线粒体功能障碍是炎症诱导的干细胞衰老的关键驱动因素。然而，其信号传导机制尚不清楚。在本研究中，我们探讨了α-酮戊二酸（α-KG）——三羧酸循环中的关键中间产物——是否能够在炎症环境中缓解线粒体功能障碍并恢复HPDLSCs的功能。体外实验表明，脂多糖（LPS）的暴露会导致HPDLSCs的线粒体膜电位下降、活性氧过度积累、细胞衰老以及成骨分化能力下降。α-KG处理显著恢复了线粒体稳态，降低了与衰老相关的β-半乳糖苷酶活性及P16和P53的表达，并增强了成骨分化能力。机制上，α-KG显著激活了AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）信号通路；而AMPK的 pharmacological 抑制则消除了α-KG对线粒体功能、细胞衰老和成骨作用的保护效应。进一步分析发现，α-KG恢复了肝激酶B1（LKB1）的表达，LKB1是AMPK的上游关键激活因子，从而建立了α-KG/LKB1-AMPK信号通路。在牙周炎诱导的大鼠模型中，口服α-KG可以减轻牙槽骨丢失，降低与衰老相关的标志物表达，恢复牙周组织中的AMPK信号通路，并促进体内牙周组织再生。总体而言，这些发现表明AMPK依赖的线粒体修复是α-KG对抗炎症诱导的HPDLSCs衰老和成骨功能障碍的关键机制，提示α-KG可能成为炎症环境下牙周组织再生的有希望的治疗策略。
引言
牙周炎是一种影响牙齿支持结构的慢性炎症性疾病，是全球牙齿丧失的主要原因[1]。根据世界卫生组织的数据，全球近一半的成年人患有牙周炎。该疾病的发病机制涉及由牙菌斑生物膜引发的持续免疫炎症反应、氧化应激加剧以及组织修复机制受损[2][3]。除了导致局部口腔组织破坏外，牙周炎还与糖尿病和心血管疾病等系统性疾病密切相关，严重影响患者的生活质量[4]。
牙周组织的完整性和再生能力在很大程度上依赖于其内在的干细胞群体，其中牙周韧带干细胞（HPDLSCs）起着关键作用[5]。这些干细胞具有自我更新能力和多向分化潜能，能够分化为成骨细胞、成牙细胞、成纤维细胞等其他细胞类型，对于维持牙周组织稳态和损伤后的修复至关重要。然而，在牙周炎的慢性炎症环境中，HPDLSCs的功能显著受损。持续的炎症刺激（如细菌脂多糖（LPS）等病原体相关分子模式）会引发一系列细胞内病理变化，导致增殖能力下降、多向分化潜能减弱（尤其是成骨分化能力），最终导致细胞衰老。这种衰老是牙周组织再生失败的关键因素，使得牙周韧带断裂和牙槽骨吸收等破坏性过程持续进行，最终导致牙齿松动和丧失[6]。像牙周炎中的慢性炎症会加速HPDLSCs的衰老，损害其修复受损组织的能力[7][8]。因此，了解牙周炎中HPDLSCs衰老的机制对于开发有效的牙周组织再生治疗策略至关重要。
线粒体功能障碍是细胞衰老的关键因素，对HPDLSCs的衰老过程有显著影响[7][9]。作为细胞的“能量工厂”，线粒体的健康对于维持HPDLSCs的活力、自我更新能力和多向分化潜能至关重要。在牙周炎的慢性炎症环境中，持续的炎症刺激会引发氧化应激，导致活性氧（ROS）过量产生，这些活性氧会直接损伤线粒体，使线粒体膜电位（MMP）下降和ATP合成效率降低。这会引发线粒体来源的ROS激增，形成恶性循环，加剧氧化损伤[10][11]。此外，与年龄相关的线粒体质量控制系统的下降，特别是线粒体自噬功能的减弱，阻碍了受损线粒体的有效清除，导致其积累。这种全面的线粒体功能障碍最终会引发细胞周期停滞，上调与衰老相关的分泌表型（SASP），并显著损害HPDLSCs的成骨分化能力，从而加速牙周组织的衰老[12]。
AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）是细胞代谢的关键调节因子，尤其是在能量压力和线粒体功能障碍的情况下[13]。AMPK是一个由催化α亚基和两个调节亚基β和γ组成的异三聚体复合物。α亚基有两种异构体，AMPKα1和AMPKα2，分别由PRKAA1和PRKAA2编码。AMPK的激活通过上游激酶（如LKB1和CaMKK2）对α亚基的磷酸化来实现[14]。这种激活可以促进线粒体生物合成，减少氧化损伤，并恢复细胞能量平衡[15]。然而，在炎症状态下，AMPK的抑制会损害线粒体的自我修复能力。由持续炎症因素驱动的慢性炎症会抑制AMPK活性。例如，LPS诱导的ROS积累和炎症细胞因子会抑制AMPK-TFAM信号通路，损害线粒体的形态和功能。靶向AMPK激活可以提供抗炎和组织修复的好处[16]。此外，AMPK激活可以促进线粒体生物合成，调节自噬以清除受损线粒体，维持动态平衡，优化线粒体功能，减少损伤，并缓解细胞衰老[17]。研究表明，在急性肺损伤中，LPS会抑制AMPK信号通路，损害线粒体的形态和功能[18]。相反，在非酒精性脂肪性肝炎等疾病中，AMPK的 pharmacological 或遗传激活具有抗炎、抗氧化和组织修复作用[19]。因此，在牙周炎中，AMPK活性降低可能是炎症、线粒体功能障碍和HPDLSCs衰老之间的关键联系[20]。
肝激酶B1（LKB1）作为主要的上下游激酶，直接磷酸化并激活AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）。这种磷酸化事件对AMPK的激活至关重要，是细胞感知和响应能量压力的关键机制[21]。LKB1-AMPK轴在调节细胞代谢、维持线粒体功能、调控炎症反应以及控制细胞极性和生长方面起着关键作用[22]。LKB1表达或活性的失调会损害AMPK的激活，导致代谢功能障碍、氧化应激积累，并增加对各种病理状态（包括癌症、糖尿病、心血管疾病和牙周炎等炎症性疾病）的易感性[23]。因此，LKB1-AMPK信号通路是代谢和炎症性疾病的治疗关键靶点。在本实验中，我们假设α-酮戊二酸（α-KG）可能通过调节LKB1来调控AMPK的磷酸化。
α-酮戊二酸（α-KG）是三羧酸（TCA）循环中的关键中间产物，最近因其潜在的缓解线粒体功能障碍和细胞衰老的作用而受到关注[24]。研究表明，它能够支持线粒体功能，减少氧化应激，并促进细胞年轻化[25][26]。研究指出，α-KG可以通过恢复线粒体功能和代谢平衡来增强骨髓间充质干细胞（BMSCs）的增殖和修复能力[27]。然而，牙周炎患者龈沟液中的α-KG水平较低[28]。此外，α-KG被认为可以影响关键的衰老相关通路，包括调节AMPK信号通路[29]。研究表明，α-KG在癌细胞对能量压力的代谢适应中发挥作用，通过维持TET-YBX1依赖的AMPK翻译[14]。最近的研究强调了α-KG在缓解细胞衰老和改善多种细胞类型线粒体健康方面的益处[30][32]。我们的研究重点在于靶向补充α-KG是否能够改善牙周炎中HPDLSCs的衰老和成骨障碍。
本研究旨在探索α-KG在缓解LKB1-AMPK介导的线粒体功能障碍和改善牙周炎引起的炎症状态下HPDLSCs衰老方面的治疗潜力。我们重点关注α-KG对HPDLSCs的线粒体功能、氧化应激和细胞衰老的影响，旨在提供一种新的策略来增强炎症条件下的牙周组织再生。
部分内容
细胞分离与培养
人类牙周韧带干细胞（HPDLSCs）从接受正畸治疗的患者的前磨牙健康牙周组织中分离获得。这些组织用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗后切成小块，然后在含有10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素（Gibco, USA）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。
线粒体功能障碍和HPDLSCs衰老是牙周炎的关键致病机制
为了探讨炎症微环境如何影响HPDLSCs的线粒体功能和细胞衰老，我们使用LPS处理来模拟牙周炎相关的炎症。MitoTracker Red染色显示，LPS处理减弱了HPDLSCs线粒体的荧光强度并改变了其形态（图1A）。同时，JC-1染色表明，在LPS刺激组中，线粒体JC-1探针的红色聚集物减少
讨论
本研究旨在评估α-酮戊二酸（α-KG）对牙周炎诱导的人类牙周韧带干细胞（HPDLSCs）衰老的影响，重点探讨其缓解AMPK介导的线粒体功能障碍的能力。体外和体内实验均显示，α-KG在炎症条件下显著增强了HPDLSCs的线粒体功能，通过AMPK信号通路延缓了衰老，从而促进了牙周组织的再生。
虽然α-KG
CRediT作者贡献声明
张欣：撰写——原始稿件、可视化、资源管理、方法论设计、实验实施、数据整理、概念构思。李凌霜：撰写——原始稿件、监督、实验实施。刘宏瑞：软件操作、方法论设计、实验实施、数据整理。张耀光：可视化处理、监督、实验实施。吴永伟：实验实施、数据分析、数据整理。孙长云：撰写——审稿与编辑、项目管理、方法论设计、资金申请
伦理批准和参与同意
本研究中的所有动物实验均遵循美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南。山东大学口腔学院的实验动物管理和使用委员会批准了所有动物实验（批准编号：20250423）。
资助
本研究部分得到了国家自然科学基金（编号82370999和82571137）对郭杰的支持；项目ZR2025MS1332得到了山东省自然科学基金的支持；项目ZR2023QH352得到了山东省自然科学基金的支持；泰山学者（编号tstp20221160）授予了李敏。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
