Rad26ATRIP的RPA结合域与KKRK基序在扰动DNA复制叉处协同启动检查点信号传导

《PLOS Genetics》：The RPA-binding domain and the KKRK motif in Rad26ATRIP cooperate at the perturbed DNA replication fork for initiating checkpoint signalling

本研究以裂殖酵母为模型，挑战了当前ATR检查点启动模型中RPA结合绝对必要的观点。研究发现，Rad26ATRIP的RPA结合域（RBD）缺失仅适度削弱检查点功能；而与DNA结合相关的KKRK基序单独突变也仅造成轻微缺陷。然而，当两者同时突变时，在羟基脲（HU）处理引起的复制叉扰动处，Rad3ATR激酶信号传导几乎被完全消除，揭示了这两个功能单元在复制叉处协同启动DNA复制检查点（DRC）的新机制。有趣的是，这种双重突变对细胞抵抗多种DNA损伤剂的敏感性影响较小，提示DNA损伤位点的检查点启动可能遵循不同的、较少依赖Rad26这两个功能单元的机制。本研究为理解检查点启动的精确调控提供了新的视角。

　　

引言

基因组完整性受到多种因素的挑战，真核生物进化出了包括细胞周期检查点系统在内的多种机制来维持其稳定。ATR（ATM and Rad3-related）激酶通路主要负责响应复制压力和各种DNA损伤。当前模型认为，复制蛋白A（RPA）包裹的单链DNA（ssDNA）为包括ATR-ATRIP复合物在内的检查点传感器蛋白组装提供了平台，这对于启动检查点信号传导至关重要。然而，先前在裂殖酵母Ssb1（RPA大亚基）和芽殖酵母Rfa1中筛选检查点缺陷突变体的研究结果，对这一模型的普遍性提出了疑问。为了更深入理解检查点启动机制，本研究将目光投向了Rad3的伙伴蛋白Rad26（ATRIP的同源物）。

结果

Rad26^ATRIP的N端区域促进Rad3^ATR激酶信号传导

尽管Rad26与其在人（ATRIP）和芽殖酵母（Ddc2）中的同源物在氨基酸序列上保守性不高，但AlphaFold预测显示其三维结构相似。研究人员构建了Rad26 N端区域的一系列缺失突变体。发现缺失前30个氨基酸（?30）会适度增加细胞对羟基脲（HU）和甲基甲烷磺酸酯（MMS）的敏感性，并减弱Rad3对底物Mrc1^Claspin（在DRC通路中）和Chk1（在DDC通路中）的磷酸化。这些结果表明Rad26的N端区域对其检查点功能有贡献。

鉴定Rad26中的RPA结合域（RBD）

通过免疫共沉淀实验，研究发现Rad26能与RPA大亚基Ssb1结合，且这种结合不依赖于HU处理，表明是组成型的。缺失前20或30个氨基酸完全消除了Rad26与Ssb1的结合，证明N端存在一个RPA结合域。进一步的定点突变研究将关键结合残基定位在N端前30个氨基酸内的两个酸性基序（DEE15和DEE24）以及一个关键疏水残基F18上。AlphaFold3建模和等温滴定量热法（ITC）实验证实，Rad26的RBD与Ssb1的N端F结构域直接相互作用，涉及电荷和疏水相互作用，且这些相互作用是相互依赖的。

消除RBD对Rad3^ATR激酶信号传导仅有轻度或中度影响

令人意外的是，尽管?30突变或F18-DEE15,24组合突变完全破坏了Rad26与RPA的结合，但Rad3的激酶信号传导（表现为Mrc1和Chk1的磷酸化）仅受到中度削弱，细胞对HU和MMS也只表现出中度敏感。这与当前认为RPA结合对检查点启动至关重要的模型相悖，暗示可能存在冗余机制。

KKRK基序在检查点中的次要作用

Rad26中包含一个在芽殖酵母Ddc2中保守的KKRK基序，该基序在芽殖酵母中被证明可结合DNA并对检查点功能至关重要。然而，在裂殖酵母Rad26中，突变该基序（即使是四个碱性残基同时突变）仅导致轻微的检查点缺陷和对HU的中度敏感，对MMS敏感性影响很小。这表明在裂殖酵母中，KKRK基序的作用有限或与其他因子功能冗余。

RBD与KKRK基序的联合突变几乎消除复制叉处的Rad3信号传导

为了寻找冗余因子，研究人员将RBD突变（?30或F18-DEE15,24）与KKRK基序突变组合。结果显示，这种组合突变使细胞对HU的敏感性急剧增加，远超过单个突变。相应地，在HU处理下，Rad3对Mrc1的磷酸化信号几乎被完全消除。然而，在MMS处理下，Chk1的磷酸化虽有所降低，但仍保留中等水平。核质分离实验证实，组合突变并未影响Rad26的核定位。当将F18A与KKRK组合突变整合到基因组位点时，在Rad26蛋白水平正常的情况下，依然观察到严重的HU敏感性和Mrc1磷酸化缺陷，这有力地支持了上述结论。这些发现表明，Rad26的RBD和KKRK基序在受扰动的复制叉处协同作用，启动Rad3激酶信号传导。

KKRK基序的DNA结合活性微弱

DNA下拉实验表明，全长Rad26能结合DNA，但KKRK基序的突变并未影响这种结合。AlphaFold建模显示KKRK基序并不直接接触DNA。纯化的包含KKRK基序的Rad26片段（185-211aa）在体外显示出微弱（微摩尔级）的ssDNA结合活性，dsDNA结合活性更弱，且KKRK突变消除了此活性。这表明，该基序本身具有较弱的DNA结合能力，但对全长Rad26的DNA结合贡献不大。

Rad26突变体对DNA损伤的抗性

与对HU的高度敏感形成对比，携带RBD和KKRK组合突变的细胞对MMS和紫外線（UV）仅表现出中度敏感，而对引起DNA链断裂的试剂如喜树碱（CPT）和博来霉素（bleomycin）则几乎完全抵抗。这说明，尽管该组合突变严重破坏了复制叉处的检查点启动（DRC），但对DNA损伤位点的检查点启动（DDC）影响较小，尤其是对链断裂损伤。

讨论

本研究通过综合遗传学、生物化学和结构建模方法，揭示了裂殖酵母中Rad26^ATRIP启动检查点的新机制。研究证实Rad26 N端存在一个直接与RPA结合的RBD，但单独破坏该结合仅导致中度表型，这与当前模型不符。关键发现在于，Rad26的RBD与一个保守的KKRK基序相互合作，在受扰动的复制叉处有效启动Rad3信号传导。这种协同机制可能也存在于其他真核生物中，有助于解释此前在不同模型系统中关于RPA结合重要性的争议性观察。

此外，染色体外表达在本研究中被证明是分析Rad26突变体的可靠方法，因为它避免了某些突变体在基因组整合后蛋白水平不稳定的问题。

RBD与Ssb1-F结构域之间相互依赖的结合模式，以及其与KKRK基序的协同，可能是一种精细的噪声控制机制，确保检查点信号仅在真正的复制压力下被有效启动，而非由RPA的局部富集产生假信号。

最后，研究发现RBD和KKRK组合突变对DNA损伤剂（尤其是链断裂损伤）的敏感性影响有限，强烈提示在DNA损伤位点，检查点启动可能依赖于与复制叉处不同的机制，或许涉及其他DNA修复蛋白对检查点传感器的招募。这一发现为未来研究指明了新的方向。