《Enzyme and Microbial Technology》：Impacts of microchannel parameters on CLEAs immobilization
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交叉酶聚集体（CLEAs）与微通道反应器结合优化催化性能，研究微通道几何参数（形状、直径、长度）及沟槽特征（形状、深度、尺寸、密度）对CLEAs固定化及酶活性的影响，并采用CFD模拟分析酶颗粒尺寸对流体动力学的影响。实验表明，波形微通道（直径2.0mm，长度50cm）、三角沟槽（深度1.0mm，尺寸1.2mm2，密度2个/cm2）条件下，固定化尿素酶-CLEAs反应器（MRIC）催化活性达1.450 U/cm2，较游离酶反应器（MRFU）提升4.63倍，且重复使用性更优。
刘畅|尹子豪|马晨峰|王曙光
北京化工大学化学工程学院，中国北京100029
摘要
交联酶聚集体（CLEAs）适用于微化学技术，但其局限性限制了其应用范围。将CLEAs与微通道结合使用可以克服这些局限性。然而，目前尚不清楚微通道参数如何影响CLEAs的固定效果。本研究探讨了微通道（几何形状、直径、长度）及其凹槽（形状、深度、尺寸、密度）对尿素酶-CLEAs固定效果的影响。此外，还通过计算流体动力学（CFD）模拟分析了CLEAs颗粒大小对微通道内流体流动的影响。结果表明，在以下最佳条件下，装有固定尿素酶-CLEAs的微通道反应器（MRIC）表现出最高的活性：波形微通道，微通道长度为50.0毫米，微通道直径为2.0毫米，凹槽深度为1.0毫米，凹槽面积为1.2平方毫米，凹槽密度为2.0个颗粒/平方厘米。MRIC的活性达到了1.450 U/cm2，是自由尿素酶微通道反应器（MRFU）的4.63倍。此外，MRIC的重复使用性也优于MRFU。CFD模拟还证实，CLEAs的存在会干扰微通道内的局部流速。研究表明，CLEAs与微通道的结合是一种制备酶微通道反应器的有效策略。
引言
交联酶聚集体（CLEAs）是一种无需载体的新型固定化方法，因其制备简便、结构稳定性和操作稳定性高而备受关注[1]。许多酶已被成功用于制备CLEAs，例如漆酶[2]、过氧化物酶[3]、转氨酶[4]、麦芽糖淀粉酶[5]、阿魏酰酯酶[6]和角质酶[7]。CLEAs的制备过程包括两个主要步骤：酶分子的物理聚集和蛋白质聚集体的化学交联。聚集通常由一种或多种沉淀剂（如无机盐、有机溶剂、非离子聚合物）诱导，而交联则通过双功能试剂（如戊二醛、genipin、右旋糖酐、壳聚糖）完成[8]、[9]。
与自由酶相比，CLEAs具有更好的热稳定性、操作稳定性、储存稳定性和溶剂稳定性[10]、[11]、[12]、[13]、[14]。CLEAs的强稳定性归因于其三级结构的高刚性。广泛的交联可防止多聚酶解离，多点附着则能防止构象变性[15]。然而，CLEAs在工业中的应用仍然有限，因为还有一些问题需要解决[16]，例如难以控制CLEAs的颗粒大小[17]、难以回收微小的CLEAs[18]、大分子底物的传质受限[19]，以及适应传统反应器系统的能力较差[20]。更严重的是，CLEAs的强粘附性使其难以重复使用[21]。将CLEAs固定在合适的支撑物（如反应器壁）上可能克服这些挑战，从而提高其活性和重复使用性[22]。
反应器被广泛用于固定自由酶，大量研究证实这是一种有效的方法[23]、[24]、[25]。近年来，微通道反应器因具有较高的表面积与体积比、短的扩散距离[26]、对流动和温度的精确控制、高反应速率以及较低的试剂消耗量[27]、[28]而受到广泛关注。微通道反应器已被用于固定多种自由酶[29]，如脂肪酶[30]、醛缩酶[31]和儿茶酚-1,2-双加氧酶[32]。这些研究表明，微通道可以提高酶的活性保留率、促进产物分离并精确控制反应条件[33]。
将CLEAs与微通道反应器结合使用也可能是一种有效策略[34]。这是因为微通道反应器具有较大的比表面积，为CLEAs的固定提供了更多位点，同时CLEAs的粘附性有助于其在微通道上的固定。此外，通过精确控制酶、沉淀剂和交联剂的浓度，可以调节固定化CLEAs的颗粒大小。在这种组合中，CLEAs的粘附性反而成为其固定的有利因素。马晨峰等人（2025年）[34]研究了CLEAs在微通道反应器中固定的最佳条件，并证实了这一方法的可行性。先前的研究表明，微通道的几何形状、表面粗糙度、流速和剪切应力等参数会影响酶的固定效率和催化性能[35]。这些效应在CLEAs与微通道反应器的组合中也可能存在，但目前了解甚少。
本研究探讨了微通道参数对CLEAs在微反应器中固定的影响，包括不同的微通道几何形状、长度、直径以及凹槽特性（形状、深度、尺寸和密度）。在最佳条件下制备的MRIC的稳定性也得到了评估。为了研究CLEAs颗粒大小对微通道内流体流动的影响，采用了计算流体动力学（CFD）模拟。尿素酶被选为模型酶，因为它在尿素水解、废水处理、医学诊断和水资源回收系统中具有广泛应用[36]。我们假设微通道反应器参数会对CLEAs的固定产生显著影响，而CLEAs的颗粒大小也会影响微通道内的流体流动。
酶和化学品
尿素酶（≥1 U/mg）购自中国连云港的益世久生物技术有限公司。聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）的厚片（5.0毫米）和薄片（1.0毫米）购自中国的硕金有限公司。所有溶剂和化学品均购自中国的北京化学试剂有限公司，均为分析级。
微通道反应器的制备
微通道反应器的制备方法基于我们已发表的文章[34]。简而言之，微通道反应器包括一块薄板（1毫米厚）
微通道几何形状
本研究比较了四种不同几何形状的MRIC。其中，波形MRIC的活性最高，为0.692 U/cm2，而T型和Tree型MRIC的活性分别降低了65.7%和66.4%（见图3）。在直形微通道中，流体通常呈现层流特性，质量传递仅通过分子扩散进行，导致质量传递效率较低。波形MRIC具有弯曲的结构
结论
本研究开发了一种结合了微通道和CLEAs的新型微通道反应器（MRIC）。在最佳条件下，MRIC表现出最佳性能：微通道直径为2.0毫米，长度为50厘米，凹槽深度为1.0毫米，凹槽面积为1.2平方毫米，凹槽密度为2个颗粒/平方厘米。其活性达到1.450 U/cm2，显著高于自由尿素酶微通道反应器（MRFU）。MRIC的重复使用性也优于MRFU。CFD模拟进一步证实了这一点
资助
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：22278025）的支持。
CRediT作者贡献声明
王曙光：数据分析、概念构建。尹子豪：方法设计、数据管理。马晨峰：初稿撰写、实验设计、数据分析。刘畅：初稿撰写、方法设计、实验设计。
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
