从原始牛乳制备富含乳脂球膜成分的过程中，极脂质的变化：基于4D脂质组学和神经节苷脂质谱技术的见解

《Food Chemistry》：Changes in polar lipids during preparation of milk fat globule membrane enriched ingredients from raw bovine milk: Insights based on 4D lipidomics and ganglioside mass spectrometry

本研究跟踪了离心、搅拌、凝乳酶凝固、超滤及蒸发等步骤对牛奶中MFGM成分的影响，发现离心导致磷脂和神经节苷脂损失最显著（49%和18%），而搅拌后损失减少。通过液相色谱和4D脂质组学分析，揭示了各步骤中磷脂亚型及神经节苷脂比例的变化规律，为优化MFGM回收工艺提供依据。

　　

宋波|尹文竹|陶秀梅|刘大松|张琳娜|段素芳|张玉萌|乔·M·雷根斯坦|刘晓明|何健|周鹏

江南大学食品科学与技术学院，中国江苏省无锡市214122

摘要

牛奶脂肪球膜（MFGM）的富集过程涉及多个处理步骤，由于其脆弱的结构，这些步骤会导致成分发生变化。监测了每个步骤后极性脂质的变化。离心处理导致磷脂和神经节苷脂分别损失了49%和18%，从而产生了24种不同的脂质种类（DLS）。磷脂酰肌醇和溶血磷脂的相对丰度增加，而磷脂酰乙醇胺以及神经节苷脂GD3(d36:1)和GM3(d40:1)的相对丰度减少。搅打奶油导致磷脂和神经节苷脂分别损失了11%和7%，产生了200种不同的脂质种类。短链磷脂和磷脂酰乙醇胺的相对丰度增加，而鞘磷脂和GM3/GD3的比例降低。凝乳酶凝固导致磷脂和神经节苷脂分别损失了8%和13%，产生了37种不同的脂质种类。磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇的相对丰度降低，而鞘磷脂和溶血磷脂增加。超滤处理产生了16种丰度较低的脂质种类。蒸发处理导致多不饱和脂质/醚磷脂的含量减少。这些发现对于优化从牛奶中回收MFGM至关重要。

引言

牛奶脂肪球膜（MFGM）是围绕牛奶中脂肪滴的三层结构膜，主要由极性脂质和生物活性蛋白组成。主要的极性脂质是甘油磷脂和鞘磷脂。尽管这些成分在原始牛奶中的比例不到2%，但它们具有降胆固醇、抗菌和抗增殖的作用（Arnoldussen等人，2022年；Bhinder等人，2017年；Zanabria等人，2013年），并且有可能用于功能性配方中。商业化的MFGM富集成分通常含有6-8%的极性脂质、超过65%的蛋白质（主要是乳清蛋白）、10-16%的中性脂质和小于8%的乳糖（Raza等人，2021年）。这些MFGM富集成分主要是通过以下步骤从奶酪乳清中制备的：离心去除剩余的脂肪球，超滤去除乳糖和盐分，微滤去除低分子量的乳清蛋白，然后蒸发浓缩MFGM成分。另一种制备方法是从牛奶奶油浓缩物中开始，通过高速离心使脂肪含量超过70%（w/w），接着进行加热辅助的相变处理以获得β-血清，再通过膜过滤和蒸发处理得到MFGM富集浓缩物（Raza等人，2021年）。这两种制备过程都涉及多次热处理，这可能会导致MFGM中的生物活性成分变性或减少（Xiong等人，2020年）。

另一种制备MFGM富集成分的替代方法是将奶油（脂肪含量约40%，w/w）搅打成酪乳，酪乳的成分与脱脂牛奶相似，但含有更多的MFGM片段（Rombaut, Dejonckheere, & Dewettinck, 2006年）。下一步是通过凝乳酶凝固、酸沉淀或借助酪蛋白水解或钙螯合进行酪蛋白去除。与酸沉淀相比，凝乳酶凝固在乳清中保留了更多的MFGM成分（尤其是极性脂质）。水解或螯合辅助的膜分离会导致大量MFGM成分流失到渗透液中（Konrad等人，2013年；Rombaut, Dejonckheere, & Dewettinck, 2006年；Song, Liu等人，2024年；Song, Lu等人，2024年）。从酪乳中得到的凝乳酶乳清是一种有潜力的中间产物，可以通过后续的膜过滤和蒸发处理制备出MFGM富集成分。

MFGM成分在多步骤处理过程中容易丢失，这是由于MFGM的脆弱结构、各成分的物理化学性质、它们在MFGM层中的分布不均匀以及脂肪滴的大小分布所致（Ferreiro & Rodríguez-Otero, 2018年）。在分离脂肪滴的过程中，MFGM成分富集在奶油中，而一些小脂肪滴及其MFGM成分则丢失在脱脂牛奶中（Holzmüller & Kulozik, 2016年）。在搅打奶油的过程中，脂肪滴被破坏，释放出MFGM片段进入酪乳中，而一些具有较高拉普拉斯压力的小脂肪滴可能不会被破坏，从而可能改变酪乳的极性脂质组成（Rombaut, Camp, & Dewettinck, 2006年）。在酪乳的凝乳酶凝固过程中，MFGM片段释放到乳清中，而一些MFGM片段则被酪蛋白凝块捕获而丢失（Sachdeva & Buchheim, 1997年）。在酪乳乳清的超滤过程中，MFGM片段被浓缩，同时去除了乳糖和盐分；然而，一些成分可能会从MFGM片段中解离并随渗透液流失（Rombaut等人，2007年）。涉及热处理的步骤（如蒸发）可能会诱导极性脂质的水解和氧化（Mou等人，2022年）。

在制备MFGM富集成分的过程中，极性脂质的这些潜在变化尚未得到系统研究。Rombaut, Camp和Dewettinck（2006年）使用液相色谱法研究了酪乳和酪乳血清生产过程中脂质的分布，Ferreiro等人（2016年）研究了从酪乳制备奶酪过程中脂质的分布。液相色谱法无法分辨脂质的酰基链变体或检测到低浓度存在的极性脂质（如神经节苷脂）。因此，关于从原始牛奶制备MFGM富集成分过程中极性脂质在分子水平上的变化信息有限。四维（4D）脂质组学结合了离子迁移谱作为第四个分离维度，提高了峰容量和信噪比。这使得能够分离具有相同m/z值但在三维结构上不同的同分异构脂质，从而提高了鉴定特异性并减少了假阳性结果（Cai等人，2024年）。

在本研究中，使用液相色谱法、质谱法和4D脂质组学技术监测了原始牛奶经过连续处理成奶油、酪乳、酪乳血清、超滤凝乳乳清和蒸发凝乳乳清的过程中，磷脂和神经节苷脂的含量和组成变化。确定这些变化有助于优化处理条件，减少每个步骤中MFGM成分的损失，从而最大化最终MFGM富集成分中的MFGM成分含量。

材料

原始牛奶是在健康荷斯坦奶牛首次分娩后30至150天内清晨采集的（天子有限公司，中国江苏省无锡市）。凝乳酶来自Chr. Hansen Holding A/S（CHY-MAX? Powder Extra NB；丹麦Hovedstaden地区的H?rsholm）。L-α-磷脂酰胆碱、鞘磷脂、3-sn-磷脂酰乙醇胺、1,2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸-l-丝氨酸和l-α-磷脂酰肌醇购自Avanti Polar Lipids公司（美国阿拉巴马州Alabaster）。

处理过程中磷脂和神经节苷脂的损失

定量分析显示，在整个制备过程中五种磷脂（磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰丝氨酸（PS）和鞘磷脂（SM）的含量显著减少（图2b和c）。离心处理导致总磷脂损失最多（49%），其次是搅打奶油（11%）和凝乳酶凝固（8%）（图2b）。相比之下，超滤和蒸发处理导致总磷脂的损失最小（

结论

在从原始牛奶制备MFGM富集成分的主要处理步骤之后，极性脂质发生了显著变化。离心处理后，总磷脂损失了49%、11%、8%、0.2%和0.03%；酪乳搅打后损失了18%、7%、13%、0.2%和0%；超滤处理后损失了18%、7%、13%、0.2%和0%；蒸发处理后损失了18%、7%、13%、0%和0%。这导致了37种、200种、24种、16种和13种不同的脂质种类（DLS）。离心处理使得磷脂酰肌醇（PI）和溶血磷脂（LPL）的相对丰度增加

CRediT作者贡献声明

宋波：撰写——原始草稿、软件、方法学、研究、概念化。尹文竹：正式分析。刘大松：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、数据管理。张琳娜：软件。段素芳：研究。张玉萌：资源获取。乔·M·雷根斯坦：撰写——审阅与编辑。刘晓明：资源获取。何健：资金获取。周鹏：监督、项目管理。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究部分得到了国家乳制品技术创新中心（编号2025-JSGG-023）、中国国家重点研发计划（2023YFF1153403）、中央高校基本科研业务费（JUSRP202416004）以及中国国家外国专家项目（H20240211）的支持。