《Food Chemistry》：pH-triggered synergy of phospholipase and protease: Interfacial film reinforcement unlocks ultra-thermostable egg yolk liquid
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本研究开发了一种新型双酶系统（中性蛋白酶+磷脂酶A1），在pH4.0下协同水解蛋黄成分，显著提高热稳定性。处理后蛋黄液80℃加热20分钟及100℃加热10分钟仍保持流体性，乳化稳定性提升23倍。机制研究表明，双酶水解使蛋白质颗粒尺寸减小至0.20±0.01μm，表面疏水性降低72.6%，静电排斥增强至-28.80mV，协同抑制热诱导聚集。该成果突破了蛋黄液热加工限制，拓展了其在灭菌液体食品中的应用。
魏武|徐立根|张新月|孙浩阳|田勇|杨一轩|马哈茂德·阿布-埃勒苏德|蔡兆霞|卢立志
中国农业与农村事务部，农产品质量与安全国家重点实验室，畜禽资源（家禽）评价与利用重点实验室，浙江省农业科学院动物科学与兽医研究所，杭州310021，中国
摘要
尽管液态蛋黄在营养和功能上具有多样性，但其工业利用受到热诱导不可逆聚集的严重限制。我们开发了一种新型双酶系统（中性蛋白酶+溶血磷脂酶（PLB）），在pH 4.0条件下共同水解蛋黄成分，制备出耐热性蛋黄液，该蛋黄液在80°C加热20分钟和100°C加热10分钟后仍能保持流动性。该系统的乳化稳定性比未经处理的蛋黄液提高了23倍（ESI = 320.52）。从机制上讲，双酶水解降低了蛋白质颗粒大小（D[3,2] = 0.20 ± 0.01 μm），减少了表面疏水性（72.6%），并增强了静电排斥力（ζ电位 = -28.80 mV），从而共同抑制了热诱导的聚集。微流变学和低场核磁共振（NMR）实验证实了其持续的水结合能力和延迟的凝胶化现象。本研究克服了蛋黄液在热加工中的根本局限性，扩展了其应用范围。
引言
蛋黄是一种富含蛋白质和磷脂的天然乳液系统，由于其优异的功能特性，被广泛用于酱料、烘焙产品以及乳化饮料中（J. Li等人，2021年）。然而，工业热加工通过疏水相互作用和二硫键的形成导致蛋白质不可逆聚集，从而引起凝胶化、粘度损失和相分离（Y. Zhao等人，2021年）。这种热不稳定性严重限制了蛋黄在灭菌液态食品中的应用，例如强化蛋白质的饮料和即饮（RTD）产品，其中流动性和稳定性至关重要（Shan等人，2024年）。
虽然富含脂质的蛋白质系统在食品应用中得到广泛应用，但目前的研究主要集中在蛋白质成分上，对复杂脂质-蛋白质基质中的热稳定性探索较少。蛋黄是一种典型的脂质-蛋白质系统，按质量计算含有33%的脂质（J. Li等人，2021年），但现有研究往往忽视了脂质和蛋白质在热稳定性中的协同作用。特别是，尽管脂质在乳液稳定性中的结构和功能意义显著，但它们对蛋黄耐热性的贡献仍未被充分探索。这一差距凸显了阐明蛋黄蛋白质和脂质在抵抗热聚集方面的相互作用机制的必要性，从而推动工业应用中热稳定脂质-蛋白质系统的合理设计。
目前用于减轻热诱导蛋白质聚集的策略包括高压均质化（X. Liu等人，2023年；Sirvente等人，2007年）、多糖复合物化（Yang等人，2025年）和化学磷酸化（Kulchaiyawat等人，2016年；Q. Li等人，2022年；Yao等人，2024年）。但这些方法受到高成本、可扩展性挑战或法规合规性的限制（J. Li等人，2021年）。酶修饰因其特异性和温和条件而成为一种有前景的替代方案（Rui等人，2024年）。蛋白酶水解可以降低蛋白质分子量和表面疏水性，而溶血磷脂酶处理可以增强脂质乳化作用（Buxmann等人，2010年；Shan等人，2024年；Tang等人，2019年；Xu等人，2024年）。然而，现有研究主要关注单酶系统或双蛋白酶组合（Fu等人，2020年；Gao等人，2019年），忽略了同时针对蛋白质和脂质成分的协同潜力。酶修饰（如肽生成、磷脂重塑）与热稳定性之间的机制相互作用尚未得到充分研究，这阻碍了热稳定蛋黄基成分的合理设计。
我们假设双酶水解通过协同机制增强了蛋黄液的热稳定性。本研究旨在筛选最佳酶组合并调节pH值以控制水解程度，从而最大化蛋黄液的热聚集抵抗力。我们希望阐明分子结构、界面行为和功能性能之间的内在关系，揭示增强热稳定性的机制。这项工作重新定义了蛋黄在热加工食品中的潜力，并为复杂食品基质建立了一种可扩展的酶工程策略，从而将基础研究与工业应用相结合。
材料
新鲜鸡蛋来自Charoen Pokphand集团（中国武汉）。8-氨基-1-萘磺酸钠（ANS）从上海Macklin生化科技有限公司（中国上海）购买。SDS-PAGE试剂盒和加载缓冲液由Biosharp生命科学有限公司（中国安徽）提供。荧光异硫氰酸酯（FITC）从中国制药化学试剂有限公司（中国上海）获得。中性蛋白酶（200,000 U/g）、磷脂酶A1（200,000 U/g）等试剂也由该公司提供。
单酶水解
如图1A所示，在80°C加热20分钟后，除PLB组外，所有组的颗粒大小均显著增加，表明不同程度的热聚集（Jin等人，2013年；Zhao等人，2022a）。其中，PLA1组的颗粒大小变化最为明显，从0.22 μm增加到21.28 μm。图1C中试管底部的空间显示了蛋黄的固态。经过加热处理后，PLB组的
结论
本研究系统地研究了中性蛋白酶和PLB对蛋黄液功能特性的联合影响。结果表明，优化的双酶系统（0.4% w/v中性蛋白酶 + 0.2% v/v PLB，在pH 4.0条件下）通过分子重构协同抑制了蛋黄液中的热诱导聚集。蛋白酶有限的水解产生了亲水性肽，通过增强水合作用减少了蛋白质聚集体的大小。
CRediT作者贡献声明
魏武：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，软件使用，方法学设计，概念构思。徐立根：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，软件使用，方法学设计，概念构思。张新月：撰写 – 审稿与编辑，数据整理。孙浩阳：资料提供，实验调查。杨一轩：撰写 – 审稿与编辑，方法学设计。马哈茂德·阿布-埃勒苏德：撰写 – 审稿与编辑。蔡兆霞：项目监督
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了浙江省科技特派员团队项目（仙居鸡产业项目，2025-2029年）的支持。
