《Genes & Diseases》：Longitudinal scRNA-seq analysis reveals molecular features of T cell exhaustion linked to anti-PD-1 response in hepatocellular carcinoma
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肝细胞癌免疫检查点封锁疗效受限，其肿瘤微环境在决定疗效中起关键作用。本研究通过对接受抗PD-1治疗的肝细胞癌患者治疗前后配对的肿瘤活检和血液样本进行单细胞RNA测序，深入解析了与不同治疗反应相关的T细胞状态差异，刻画了从祖耗竭到终末耗竭细胞的发育轨迹，鉴定出关键耗竭相关基因，并揭示了T细胞耗竭与恶性上皮细胞亚群之间的关联，为增强晚期肝细胞癌免疫治疗效果提供了新的见解。
在全球范围内，肝细胞癌是癌症相关死亡的第三大常见原因。尽管针对程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1) 等靶点的免疫检查点封锁疗法已成为治疗晚期肝细胞癌的重要手段，但客观缓解率仍然徘徊在15%–20%之间，仅有一部分患者能够从中获益。这种治疗反应的巨大差异，很大程度上归因于肝癌及其肿瘤微环境的高度异质性。肿瘤微环境中包含各种类型的细胞，其中耗竭CD8+T细胞 (Tex) 是免疫治疗的主要靶标，旨在恢复其抗肿瘤功能。然而，Tex细胞并非均一的群体，它们沿着从祖细胞样 (Texp) 到终末耗竭 (Text) 状态的连续体发育，其中Texp细胞与更佳的临床预后相关。因此，深入理解Tex细胞在免疫治疗前后的分子和细胞动态变化，对于揭示治疗响应的机制、克服耐药性至关重要。为解决上述问题，研究人员对十名肝细胞癌患者在接受抗PD-1疗法前后获得的十四份肿瘤活检和八份血液样本（包括四份配对样本）进行了单细胞RNA测序分析，相关研究成果已发表在《Genes》期刊。
本研究主要采用的关键技术方法包括：单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 用于全面解析肿瘤微环境的细胞组成和转录组特征；通过均匀流形近似和投影 (UMAP)、t-SNE进行细胞亚群的降维、聚类和可视化；利用Monocle2和Slingshot算法进行细胞发育轨迹和拟时序分析；通过RNA速度 (RNA velocity) 技术推断细胞命运方向；应用基因集富集分析 (GSEA)、基因集变异分析 (GSVA) 探究功能通路变化；使用CellChat工具推断细胞间通讯网络；此外，研究还结合了来自基因表达综合 (GEO) 数据库、癌症基因组图谱 (TCGA) 数据库的公共数据集进行独立验证，并建立了小鼠皮下肝癌模型和体外T细胞耗竭模型，通过流式细胞术、荧光激活细胞分选 (FACS)、定量反转录聚合酶链反应 (qRT-PCR) 等方法对关键发现进行了功能验证。
研究结果
抗PD-1反应相关细胞亚型与肿瘤微环境分子特征
研究人员通过对治疗前后样本的分析，在肿瘤微环境中鉴定出十一个不同的细胞簇，包括T细胞、自然杀伤细胞、上皮细胞等。尽管治疗前后整体细胞组成变化不大，但对四名有配对样本的患者进行深入分析发现，治疗前的分子特征已能区分后续的治疗应答者与非应答者。应答者在治疗前表现出更高的免疫调节和吞噬作用相关通路活性。治疗后，这种差异更为显著。与TCGA数据交叉比对发现，应答者富集了更多与良好临床结局相关的基因，并且T细胞激活相关基因在应答者中显著上调，但在非应答者中下调。这表明应答者在治疗前就已具备免疫活化的肿瘤微环境，治疗进一步强化了这种协调的分子免疫反应。
不同的T细胞状态是治疗反应差异的基础
对T细胞区室的分析将T细胞分为十一个亚群。分析发现，治疗后，应答者组中的Tex细胞和调节性T细胞 (Treg) 显著减少，而非应答者组中却有所增加。在功能上，应答者组的Tregs在治疗后富集了与免疫激活、T细胞分化和白细胞介素-2 (IL-2) 产生相关的通路，而非应答者组的Tregs则转向脂质代谢。此外，非应答者组的T细胞在治疗前就表现出更高的共抑制受体和免疫抑制分子表达。治疗后，应答者组的T细胞在抗原呈递和T细胞激活通路上显著富集，而非应答者组则显示出以组蛋白修饰和细胞质翻译为主的基因表达谱。组织学分析也证实，应答者组在治疗前后都表现出更高的CD8+T细胞浸润，并且治疗后Tex细胞减少，而非应答者组则积累更多Tex细胞。通路分析证实，抗PD-1治疗后，积极的免疫调节信号仅在应答者组广泛上调。
从祖细胞到终末耗竭的分化轴决定治疗反应
鉴于T细胞耗竭在治疗抵抗中的关键作用，研究进一步将Tex细胞分为三个功能状态：祖耗竭T细胞1 (Texp1)、祖耗竭T细胞2 (Texp2) 和终末耗竭T细胞 (Text)。常见免疫检查点分子主要在Text亚群中表达。临床结果与这些亚群分布显著相关：应答者中保有较高比例的Texp1和Texp2细胞，而非应答者则主要由Text亚群组成。治疗后，非应答者中Text细胞在总CD8+T细胞中的比例增加，而应答者中未观察到这种积累。因此，对抗PD-1治疗的反应不仅取决于Tex细胞的存在，更取决于其发育阶段，保有祖耗竭T细胞储备与良好的治疗反应相关。
发育轨迹分析鉴定出与T细胞耗竭相关的关键基因，并在多个模型中验证促耗竭分子
通过重建肿瘤浸润Tex细胞的发育轨迹，研究证实了从Texp到Text细胞的序贯分化路径。拟时序分析确定了四个在耗竭进程中逐渐上调的关键基因：ATP1B3、GRAMD1B、BAZ1A和METRNL。基于这四个基因表达水平构建的耗竭促进评分与患者不良预后和肿瘤微环境中Tex细胞浸润增加密切相关。这些基因的表达模式在患者外周血Tex细胞、小鼠皮下肝癌模型中分离的Tex细胞以及体外慢性刺激诱导的T细胞耗竭模型中均得到验证。特别值得注意的是，在体外耗竭过程中使用BAZ1A抑制剂处理，能显著减轻T细胞耗竭并抑制细胞凋亡，这首次提示BAZ1A可能在促进T细胞耗竭中发挥作用。
T细胞耗竭与导致治疗抵抗的恶性上皮细胞亚群相关
通过对上皮细胞进行拷贝数变异 (CNV) 分析，研究鉴定出恶性上皮细胞群。对治疗前非应答者样本中恶性上皮细胞的功能通路分析显示，氧化磷酸化、脂肪酸代谢和p53信号通路显著富集。细胞通讯分析发现，与Texp1细胞相比，恶性细胞与Text或Texp2细胞之间存在更广泛的相互作用，其中TIGIT和CXCL信号网络显示出更强的相互作用。研究还发现，之前鉴定出的预后相关长链非编码RNA (lncRNA) CASC9特异性地上皮细胞中表达，并主要存在于恶性上皮细胞中。T细胞耗竭评分和CASC9表达水平均能有效预测患者生存结局，且两者呈显著正相关。对不同上皮细胞亚群与Tex亚群之间通讯的进一步分析揭示，高表达CASC9的恶性上皮细胞与Tex细胞之间的相互作用网络中，ALCAM (CD166)–CD6信号通路显著富集，提示该亚群可能通过ALCAM–CD6免疫检查点轴，促进T细胞向终末耗竭状态分化。
研究结论与意义
本研究通过整合单细胞转录组图谱和关键分子验证，揭示了肝细胞癌患者对抗PD-1治疗产生应答与非应答的多层次机制。研究发现，应答者在治疗前就存在免疫学上更活跃的肿瘤微环境，治疗则进一步通过上调T细胞激活相关基因增强了这种活性。T细胞的功能状态，特别是其耗竭的分化阶段，是决定疗效的关键。研究成功构建了基于转录相似性的T细胞耗竭谱系，并通过谱系分化分析首次鉴定出一组潜在的促耗竭分子 (ATP1B3, GRAMD1B, BAZ1A, METRNL)，其中BAZ1A被证明在体外模型中能促进耗竭。此外，研究还揭示了肿瘤细胞异质性的重要性，发现lncRNA CASC9在恶性上皮细胞中特异性高表达，并且其表达与耗竭评分正相关。CASC9高表达的恶性上皮细胞亚群可能通过ALCAM–CD6信号轴与Tex细胞相互作用，驱动其向终末耗竭状态分化。
这项研究的意义在于：它从单细胞层面纵向解析了肝细胞癌免疫治疗过程中的动态变化，不仅深化了对T细胞耗竭发育轨迹的理解，还建立了肿瘤恶性上皮细胞特性与免疫细胞功能状态之间的直接联系。所鉴定的关键基因 (如BAZ1A) 和信号通路 (如ALCAM–CD6) 为开发新的联合治疗策略（例如，靶向耗竭促进分子或阻断促耗竭的细胞间通讯）提供了潜在的靶点。该研究提出的基于转录谱的细胞亚群分析新策略，也为未来精准免疫治疗的研究提供了重要的方法论参考。
