《International Journal of Biological Macromolecules》：Positive membrane curvature induced by a CFEM-domain protein is essential for fungal invasion of the host
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真菌感染中CFEM7蛋白通过诱导膜正曲率促进穿透机制研究。
彭月进|康润山|张浩|王光|涂文强|詹天娇|刘青青|王新义|陈斌|应胜华|杨凯
中国云南省农业大学植物保护学院，昆明，650201
摘要
无性孢子的萌发是真菌感染宿主的关键步骤之一。关于病原真菌如何感染宿主的研究已经非常广泛，这些研究揭示了水解酶、膨压、机械力和正弦波状顶端生长在感染过程中的作用。然而，此前尚未有研究将参与膜弯曲的蛋白质与真菌感染机制联系起来。本研究表明，CFEM结构域蛋白CFEM7能够在昆虫病原真菌Beauveria bassiana中诱导细胞质膜的正向弯曲，从而促进真菌芽管的弯曲并帮助其穿透昆虫角质层。我们的结果表明，BbCFEM7的缺失显著降低了芽管的弯曲度和分生孢子的萌发率，削弱了真菌穿透和感染昆虫宿主的能力。ΔBbCFEM7突变体的芽管弯曲度明显低于野生型（WT）和ΔBbCFEM7::BbCFEM7替代菌株。分子动力学模拟和生物物理实验证实，BbCFEM7直接整合到磷脂双层中，诱导膜的正向弯曲。进一步在ΔBbCFEM7菌株中表达截短形式的BbCFEM7的实验表明，BbCFEM7的1–194个氨基酸残基是诱导膜弯曲的关键区域。这一发现为真菌感染机制提供了新的视角，并为开发新的生物控制策略提供了潜在靶点。本研究建立了诱导膜弯曲的蛋白质与真菌致病性之间的直接关系。
引言
细胞质膜作为最外层的细胞结构，不仅作为将细胞与外部环境分隔开的物理屏障，还在信号转导、物质运输、细胞极性形成和细胞间相互作用中发挥着重要作用。在微生物中，细胞质膜在感染过程中也至关重要。例如，感染动物或植物的病原真菌会形成专门的感染结构，如Magnaporthe oryzae [1]和Metarhizium spp. [2]中的附着器，或者像Candida albicans [3]和Beauveria bassiana [4]那样通过孢子萌发产生芽管。B. bassiana是一种丝状真菌，对昆虫具有致病性，在自然环境中普遍存在，它通过控制节肢动物害虫来占据独特的生态位[5]。B. bassiana的种群增长对其感染周期至关重要：分生孢子附着在昆虫角质层上并在适宜条件下萌发形成芽管。这些芽管分泌酶（如几丁质酶和蛋白酶），分解昆虫角质层中的几丁质和蛋白质。随后，芽管穿透角质层并繁殖[6]。一旦昆虫组织受损，昆虫就会死亡，真菌菌丝从角质层表面生长出来，产生大量分生孢子[7]。这些分生孢子随后寻找新的宿主，启动新的感染周期。
在整个感染周期中，真菌的细胞质膜会经历持续的结构变化。人们普遍认为，细胞质膜具有高度动态性，能够快速而精确地调整其形状以满足多种细胞功能[8]。所有细胞都拥有复杂的膜系统，包括细胞质膜和内部膜结构。膜重塑主要通过膜弯曲的形成和调节来实现，这一过程由蛋白质和脂质之间的相互作用驱动[9]、[10]、[11]、[12]。对内部膜系统的研究表明，某些嵌入或整合在膜中的蛋白质能够诱导膜弯曲，这类蛋白质被称为膜弯曲诱导蛋白[13]。膜弯曲的变化不仅对内部膜结构的形成至关重要，也对细胞器的生物发生、膜运输、细胞分裂和细胞迁移至关重要[14]。例如，从酵母到人类高度保守的BAR（Bin/Amphiphysin/Rvs）结构域蛋白（包括经典BAR、N-BAR和F-BAR）通过产生膜弯曲来促进内吞和外吞作用[15]、[16]。此外，细胞还拥有许多膜弯曲感应蛋白，如clathrin和caveolin，它们能够特异性识别并响应膜弯曲的变化，从而影响细胞行为和形态[17]、[18]。膜弯曲诱导蛋白和膜弯曲感应蛋白在细胞质膜重塑过程中协同作用。尽管这些膜弯曲蛋白在调节脂质膜的形态变化中起着关键作用，但关于它们的遗传和病理机制的研究仍然很少[19]、[20]。
多种方法，包括原子模拟、粗粒化模型和连续介质力学，已被用于研究生物膜中的蛋白质-脂质相互作用，从而加深了我们对膜重塑以及弯曲感应和诱导机制的理解[21]、[22]。这些相互作用可以引发具有不同弯曲特性的多种膜形态。例如，Epsin-1促进clathrin包裹的凹陷形成，表现为具有正向膜弯曲的向外突起[23]。相反，如反向Bin/Amphiphysin/Rvs（I-BAR）结构域家族和干扰素诱导的跨膜蛋白3（IFITM3）这样的蛋白质则诱导具有负向弯曲的向内凹陷[24]。尽管取得了这些进展，但膜弯曲诱导蛋白的分子机制和生物学作用仍不甚明了。值得注意的是，它们在病原真菌中的功能尚未被阐明。
在本研究中，我们首次发现了一种膜弯曲诱导蛋白BbCFEM7，它能够直接促进病原真菌B. bassiana质膜的正向弯曲。CFEM（Common in Fungal Extracellular Membrane）结构域蛋白是一类独特的真菌细胞外膜蛋白[25]，含有八个保守的半胱氨酸残基，这些残基能够结合血红素，有助于真菌铁的吸收[26]，从而支持其入侵和定殖。近年来，CFEM结构域蛋白在昆虫病原真菌[27]、[28]、[29]、植物病原真菌[30]、[31]和人类病原真菌[32]、[33]中得到了广泛研究。然而，跨膜CFEM结构域蛋白与细胞质膜之间的相互作用尚未被探索。通过生物物理模拟和生物实验，我们阐明了BbCFEM7在真菌感染中的作用机制。这是首次证明真菌感染受到膜弯曲直接变化的影响，解释了为什么真菌孢子在萌发阶段就开始感染，而此时宿主的几丁质和脂质尚未被酶水解。此外，这项研究还为微生物如何感染宿主提供了新的见解。
菌株和培养条件
野生型菌株Beauveria bassiana ARSEF 2860来自美国农业部ARSF菌株库。该菌株在含有酵母提取物的Sabouraud Dextrose Agar（SDAY；4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母提取物和1.5%琼脂糖）培养基上常规培养。所有真菌菌株均在25?°C下、12小时光照/黑暗的光周期条件下培养。Escherichia coli DH5α用于质粒构建，在Luria-Bertani（LB）培养基（1% NaCl、0.5%蛋白胨、0.5%酵母提取物）上培养。
BbCFEM7的缺失显著降低了真菌芽管的弯曲度
分生孢子萌发实验表明，在水-琼脂糖平板（图1A）、蝗虫翅膀（图1B）和蝉翅膀（图1C）上，ΔBbCFEM7缺失菌株的芽管弯曲度明显低于野生型（WT）和ΔBbCFEM7::BbCFEM7突变菌株。此外，ΔBbCFEM7缺失菌株的分生孢子萌发率也显著降低。BbCFEM7基因的缺失导致真菌的萌发率大幅下降。
讨论
我们的研究首次证明BbCFEM7通过诱导膜的正向弯曲来改变芽管的形态，从而促进真菌感染。我们首次发现细胞质膜蛋白BbCFEM7提供了一个关键的支架，使芽管能够灵活弯曲，从而快速感染宿主或生长介质。BbCFEM7因此在多种昆虫宿主（包括鳞翅目和鞘翅目昆虫）中的真菌致病性中起着关键作用。
结论
本研究证实了BbCFEM7是首个被证明对真菌致病性不可或缺的质膜弯曲诱导蛋白。通过嵌入双层的外层叶片，BbCFEM7的N端1–194个氨基酸片段产生了强烈的正向弯曲，赋予芽管尖端机械灵活性，使其能够定向变形以穿透昆虫角质层。BbCFEM7的缺失消除了膜弯曲，使分生孢子的萌发率降低了20%。
CRediT作者贡献声明
彭月进：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、可视化、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。康润山：方法学、实验研究、数据分析。张浩：方法学、实验研究、数据分析。王光：方法学、实验研究、数据分析。涂文强：实验研究、数据分析。詹天娇：可视化、方法学。刘青青：可视化。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（32402448、32230063）和云南省自然科学基金（202301AT070487、202401AT070244）的支持。
