β-1,3-葡萄糖基转移酶异构酶在灵芝多糖生物合成中的独特协同与互补作用

《International Journal of Biological Macromolecules》：Unique synergistic and compensatory interaction between β-1,3-glucosyltransferase isoenzyme in Ganoderma lucidum polysaccharide biosynthesis

β-1,3-葡糖苷转移酶同工酶GL24465与GL20535在灵芝多糖合成中的协同作用及调控机制研究。通过基因共沉默和过表达策略，发现单独调控GL24465对多糖产量影响较小，而两者共过表达使胞外多糖（EPS）增产89.15%，共沉默则显著降低细胞生物量及多糖含量。转录分析表明GL24465不直接调控GL20535表达，两者通过UDP-葡萄糖合成途径关键酶（PGM、UGP）的协同调控实现功能互补，揭示了同工酶间的级联调控网络及其对多糖结构的影响。

　　

Jingyun Liu | Mengmeng Xu | Yuxi Guo | Junxun Li | Lei Chen | Zhenghua Gu | Guiyang Shi | Zhongyang Ding

江南大学生物技术学院，教育部碳水化合物化学与生物技术重点实验室，中国无锡214122

摘要

在灵芝多糖（GLPS）的生物合成过程中，存在两种β-1,3-葡萄糖转移酶异构体，分别命名为GL20535和GL24465。先前的研究表明，gl20535的表达水平显著影响GLPS的产量，而沉默gl20535会导致gl24465的表达上调。然而，GL24465在多糖生物合成中的具体功能及其与GL20535的相互作用机制仍不甚明了。本研究通过单独和组合基因沉默及过表达的方法，系统探讨了GL24465和GL20535在GLPS生物合成中的作用及其相互关系。结果表明，单独调节gl24465对多糖产量的影响较小。相反，同时过表达这两种基因显著增加了细胞内多糖（IPS）和细胞外多糖（EPS）的积累，分别增加了9.92%和89.15%。相反，同时沉默这两种基因则导致细胞生物量、细胞壁厚度以及EPS和IPS含量显著降低，分别降低了13.81%、50.25%、20.52%和35.02%。共同调控还通过改变糖供体合成关键酶（包括磷酸葡糖变位酶（PGM）和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）以及葡萄糖转移酶）的转录，影响了GLPS的单糖组成和糖苷键比例。转录分析显示，gl24465表达的变化并未显著影响gl20535的转录。结合现有证据（表明GL20535是多糖合成的主要酶，而GL24465则提供补偿性支持以维持产量和结构完整性），本研究为可食用和药用真菌中葡萄糖转移酶异构体的功能协作提供了新的见解，对优化多糖的生物制造具有潜在意义。

引言

灵芝多糖（GLPS）是由多个单糖单元组成的生物大分子，主要包含通过β-1,3-、α-1,3-和β-1,6-糖苷键连接的葡萄糖和甘露糖[1]、[2]。GLPS因其抗肿瘤、抗氧化、抗抑郁和免疫调节特性而具有多种重要的生理活性[3]、[4]。β-1,3-葡萄糖转移酶催化葡萄糖基团从糖供体尿苷二磷酸（UDP）-葡萄糖通过β-1,3-糖苷键连接到受体分子上[5]。这种酶的表达水平影响GLPS的产量和结构特征，因此在多糖生物合成中起着关键作用[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。

在灵芝中，有两个编码β-1,3-葡萄糖转移酶的异构体基因，即gl20535 [6]、[8]和gl24465 [7]。据报道，GL20535是GLPS生物合成途径中的关键酶，其表达与UDP-葡萄糖合成途径中的多种关键酶（如磷酸葡糖变位酶（PGM）、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）和糖苷水解酶）相关。这些相互作用协同调节了整个多糖生物合成过程[8]。值得注意的是，gl20535的过表达[8]或其与ugp的共同过表达可以增加GLPS的产量[6]；然而，GL24465异构体的具体功能尚未得到全面阐明。

异构体通常具有保守的结构域，但在协调复杂的代谢途径时表现出功能差异。例如，几丁质合成酶（CHS）异构体参与不同的细胞过程：CHS1在细胞分裂后期修复隔膜缺陷，CHS2在有丝分裂后期介导初级隔膜的形成，CHS3合成大部分细胞壁几丁质[11]、[12]、[13]。β-1,3-葡萄糖转移酶通过一个高度保守的细胞内葡萄糖转移酶结构域（GT结构域）和跨膜通道，在酿酒酵母 [14]、草菇 [16]、军菇 [17]和灵芝 [18]中催化β-1,3-葡聚糖的合成。β-1,3-葡萄糖转移酶在可食用和药用真菌中广泛存在[19]、[20]、[21]，并表现出不同的表达模式或功能优势。例如，在草菇中，GFGLS2对生长和葡聚糖合成的贡献大于GFGLS1[20]。相比之下，灵芝中的β-1,3-葡萄糖转移酶异构体在体外表现出独立的催化活性[18]。对灵芝的研究表明，gl24465并未改变gl20535的表达[7]。此外，沉默gl20535与gl24465异构体的上调有关，但其过表达并未影响gl24465的表达[6]、[8]，这表明这两种异构体之间可能存在相互作用。

为了系统研究GL24465及其与β-1,3-葡萄糖转移酶异构体GL20535在菌丝生长和多糖生物合成中的相互作用，构建了分别单独过表达和沉默gl24465，以及同时过表达和沉默gl24465和gl20535的重组菌株。然后，我们比较了发酵过程中的菌丝生物量、多糖产量和成分特征等表型性状。随后，对关键生物合成基因进行了转录分析，以阐明这些异构体之间的相互作用。这项研究将加深我们对可食用和药用真菌中β-1,3-葡萄糖转移酶异构体功能作用的理解，并为阐明多糖合成网络背后的相互作用提供重要基础。

章节片段

菌株和培养条件

灵芝 CGMCC 5.26（广型，WT）菌株在实验室中保存[22]。对于种子培养和淹没发酵，向250毫升的Erlenmeyer烧瓶中加入80毫升液体培养基（葡萄糖（20克/升）、蛋白胨（5克/升）、非氨基酵母氮源（5克/升）、KH?PO?（5克/升）和MgSO?·7H?O（3克/升）。种子培养在30°C下以150转/分钟的速度摇动培养10天，然后将300毫克湿重的匀浆种子转移到淹没发酵培养基中。

β-1,3-葡萄糖转移酶异构体的序列分析及重组菌株的构建

利用已发表的β-1,3-葡萄糖转移酶gl24465基因组序列，成功扩增了灵芝的gDNA（6168 bp）和cDNA（5256 bp）中的gl24465序列（图2A）。预测序列[24]与gDNA序列的比对显示，扩增的cDNA中310位到507位之间缺失了198 bp的片段。这个缺失片段对应于一个典型的内含子序列“GT-AT”，表明内含子序列的注释有误（补充材料

讨论

β-1,3-葡萄糖转移酶是参与真菌多糖生物合成的关键酶，在提高多糖产量方面起着重要作用[6]、[7]、[8]、[39]、[44]、[45]、[46]、[47]、[48]。它在多种可食用真菌（如灵芝 [8]、草菇 [44]、[45]、军菇 [46]和平菇 [47]）的多糖生物合成中至关重要。在担子菌（如灵芝 [8]、[9]和草菇 [44]、[45]）中，通常存在编码两种异构体的基因

结论

本研究系统分析了β-1,3-葡萄糖转移酶GL24465的作用及其与GL20535在多糖生物合成中的相互作用。过表达或沉默gl24465并未显著影响多糖产量或gl20535的表达。同时过表达这两种基因显著增加了总多糖产量——尤其是EPS的产量。相反，同时沉默这两种基因则显著降低了多糖产量

缩写

CHS
几丁质合成酶
CR
刚果红
CFW
Calcofluor白
EPS
细胞外多糖
GT
葡萄糖转移酶
GLPS
灵芝多糖
G-1-P
葡萄糖-1-磷酸
G-6-P
葡萄糖-6-磷酸
IPS
细胞内多糖
PGM
磷酸葡糖变位酶
PMT
PEG介导的原生质体转化 PGI
磷酸葡萄糖异构酶
PMI
磷酸甘露糖异构酶
PMM
磷酸甘露糖变位酶
RT-qPCR
实时定量PCR
SDS
十二烷基硫酸钠
TEM
透射电子显微镜 UGP
UDP-葡萄糖焦磷酸化酶
UGE
UDP-葡萄糖

CRediT作者贡献声明

Jingyun Liu：撰写——原始草稿、验证、方法学、实验设计。 Mengmeng Xu：撰写——审阅与编辑、方法学。 Yuxi Guo：验证、数据分析。 Junxun Li：验证、概念化。 Lei Chen：撰写——审阅与编辑。 Zhenghua Gu：方法学。 Guiyang Shi：撰写——审阅与编辑。 Zhongyang Ding：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。

资助

本工作得到了国家自然科学基金（编号：32272283）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。