《International Journal of Biological Macromolecules》：Targeted delivery of okra polysaccharides to macrophages using a mannose-conjugated layered double hydroxide nanodelivery system
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光交联GMD水凝胶通过引入DMG增强机械性能和抗氧化能力，抑制ROS激活的p-Syk/NF-κB通路及M1巨噬细胞极化，促进BMSCs成骨分化，为骨修复提供多功能生物材料平台。
赵梦然|夏三强|吕云|陈晓毅|简新怡|徐峰|曹淼|彭恩诺|唐博林
中国嘉兴大学材料与纺织工程学院生物基健康功能纤维材料浙江省重点实验室，嘉兴，314001
摘要
光交联水凝胶被广泛用作骨骼修复和再生的支架。然而，其生物安全性不足和有限的成骨能力限制了其临床应用前景。本文通过将天然
N、
N-二甲基甘氨酸（DMG）接枝到甲基丙烯酸明胶（GelMA）上，开发了一种可见光交联的GMD水凝胶，以增强骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨潜能。该水凝胶在可见光照射下使用FMN作为光引发剂、DMG本身作为共引发剂，在约15秒内快速凝胶化，同时具有优异的注射性和3D打印性。引入的疏水二甲基氨基团在GelMA分子链之间诱导疏水相互作用，显著提高了水凝胶的机械强度和粘附力。生物实验表明，GMD水凝胶能有效清除活性氧（ROS），并通过SIRT1/PGC-1α/Nrf2信号通路促进谷胱甘肽的循环，从而抑制ROS诱导的p-Syk/NF-κB通路的激活。结果，M1巨噬细胞的极化受到抑制，形成了有利于BMSCs成骨分化的骨免疫微环境。这通过上调成骨标志物（ALP、BMP、RUNX2、Col
I、OCN）和增加矿化作用得到证实。GMD水凝胶为骨骼修复和再生提供了一个有前景的生物材料平台。
引言
由创伤、感染、肿瘤切除或先天性异常引起的骨骼缺陷在骨科手术中是一个重要的临床挑战[1]、[2]、[3]。虽然自体移植仍然是治疗的金标准，但其使用受到供体部位并发症、供应有限和潜在并发症等限制[4]。因此，开发先进的生物材料支架用于骨组织工程是一种有前景的策略，以指导成骨分化并促进骨骼再生。作为通过物理或化学交联亲水性聚合物形成的三维网络结构生物材料，水凝胶具有高水分含量、可调的机械性能和可控的降解速率，以及与天然细胞外基质（ECM）的结构相似性[5]。这些特性使水凝胶成为支持细胞生长和分化的理想支架，有助于解决严重骨骼缺陷和愈合障碍的问题。
事实上，特别是光交联水凝胶，在近年来骨骼修复和再生领域受到了越来越多的关注[6]、[7]。由于其时空可控性，光交联水凝胶可以在光照条件下按需成型，为微创输送提供优异的注射性，并通过3D生物打印技术精确成形，以匹配不规则的骨骼缺陷几何形状[8]、[9]。目前，大多数光交联系统依赖于紫外线（UV）光和相关的合成光引发剂，如苯甲酰磷酸锂（LAP），因为其交联速率极快[10]、[11]。然而，就骨骼修复和再生而言，即使少量的合成光引发剂也可能降低生物相容性，并抑制BMSCs的增殖和新骨的形成。同时，紫外线光还可能通过损伤细胞DNA而表现出潜在的细胞毒性[12]。尽管已经开发了许多可见光交联系统来降低潜在的毒性风险，但它们通常需要使用可能具有细胞毒性的共引发剂来启动聚合，从而影响水凝胶的整体生物安全性[13]。
核黄素（维生素B2）是一种高度生物相容的天然化合物，存在于各种植物和动物器官中[14]。更重要的是，核黄素在330–470纳米范围内能强烈吸收光，峰值吸收位于约350和440纳米，这使得它能够通过暴露于可见光来交联含有乙烯基的分子，而不是可能造成损害的紫外线辐射[15]、[16]。因此，作为一种有效的可见光光引发剂，核黄素在光交联水凝胶领域引起了越来越多的关注。迄今为止，核黄素已在可见光下成功交联了多种含有乙烯基的材料，包括胶原蛋白、海藻酸钠和聚（乙二醇）[17]、[18]、[19]、[20]。需要注意的是，核黄素单独在可见光照射下无法引发含有乙烯基的化合物的聚合，需要电子供体（如胺类）作为共引发剂，例如三乙醇胺、三乙胺、二丁胺和芳香胺[21]、[22]。不幸的是，许多胺类具有相对较高的潜在毒性。Chu等人报告了使用生物相容的L-精氨酸代替常用的有毒三乙醇胺作为共引发剂，通过核黄素辅助交联右旋糖酐水凝胶[23]，从而降低了水凝胶的潜在毒性。然而，交联速率非常慢（约5分钟），难以满足实际临床需求。除了生物相容性和交联速度外，可见光交联水凝胶还需要特定的功能，以应对骨骼缺陷复杂的病理微环境。骨骼损伤后，持续的损伤会导致活性氧（ROS）的积累，从而诱导巨噬细胞的M1极化并触发强烈的炎症反应[24]、[25]。随后，释放出大量炎症因子，这些因子会强烈抑制BMSCs的成骨分化和新骨的形成[26]。此外，骨骼缺陷中的细菌感染进一步复杂化了愈合过程并加剧了炎症反应[27]、[28]。因此，理想的用于骨组织生成的光交联水凝胶不仅应具有快速的可见光交联能力和高生物相容性，还应具有内在功能，以减轻氧化应激并有利于调节免疫反应，从而创造一个促进再生的骨免疫微环境。
二甲基甘氨酸（DMG）是一种具有优异抗氧化能力的天然氨基酸衍生物。研究表明，DMG可以通过激活抗氧化酶系统和提高细胞内GSH水平来缓解氧化应激[29]、[30]。更重要的是，DMG上的两个电子供体甲基显著增强了其氨基的电子供体能力。这表明它作为可见光系统中的有效共引发剂具有潜力。受此启发，我们在此报道了一种新型可见光交联水凝胶（命名为GMD）的设计和合成，方法是将天然DMG接枝到GelMA的主链上（示意图）。这种分子设计将多种功能集成到一个平台上。首先，接枝的DMG部分在整个分子链中均匀分布，作为生物相容的光引发剂FMN（核黄素的的水溶性变体）的有效共引发剂，使GMD水凝胶在可见光照射下快速凝胶化。其次，DMG引入的疏水二甲基氨基团诱导分子间的疏水相互作用，有效提高了GMD水凝胶的机械性能和组织粘附力。第三，掺入的DMG赋予了水凝胶强大的ROS清除能力，为BMSCs的成骨分化提供了有利的骨免疫微环境。我们系统地表征了GMD水凝胶的物理性能，包括凝胶化动力学、注射性、打印性和机械性能，然后评估了其抗氧化效果和潜在的分子机制。此外，我们还研究了其对巨噬细胞极化的免疫调节作用及其对BMSCs成骨分化的影响。本工作中开发的水凝胶为有效的骨骼修复和再生提供了有前景的生物材料。
材料
明胶（B型，240 Bloom）、甲基丙烯酸酐（MA）、N、N-二甲基甘氨酸（DMG）、核黄素-5′-磷酸钠（FMN）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）、4-二甲基氨基吡啶（DMAP）、2-(N-吗啉基)乙烷磺酸（MES）、三乙醇胺（TEOA）、（2,4,6-三甲基苯甲酰）磷酸酯（LAP）、伊红Y、1-乙烯基-2-吡咯烷酮（NVP）、2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基丙酮（I2959）和磷酸盐缓冲盐水（pH = 7.4）均从
GMD水凝胶的合成与表征
可见光交联的GMD水凝胶分两步合成：首先将明胶甲基丙烯酸化得到GelMA，然后通过酰胺化反应将DMG分子共价接枝到GelMA主链上。GMD的化学结构通过1H NMR和FTIR得到确认。如图1a所示，与明胶相比，δ = 5.30和5.59 ppm处的质子信号对应于甲基烯丙基[35]，而δ = 2.78 ppm处的质子峰逐渐增强
结论
总结来说，我们开发了一种可见光交联的二甲基甘氨酸接枝GelMA水凝胶（GMD），该水凝胶将快速光固化、增强的机械强度、强大的抗氧化活性和免疫调节功能整合到一个生物材料平台上。接枝的DMG作为FMN介导的光交联的有效共引发剂，能够在温和的可见光照射下实现快速凝胶化。此外，DMG赋予水凝胶强大的ROS清除能力，并激活
CRediT作者贡献声明
赵梦然：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、概念化。夏三强：撰写——原始草稿、方法学、研究、数据分析。吕云：可视化、研究、数据分析。陈晓毅：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、资金获取、概念化。简新怡：软件、方法学、研究。徐峰：可视化、数据分析。
利益冲突声明
我们提交的手稿“一种生物相容的可见光交联二甲基甘氨酸接枝明胶水凝胶通过抑制ROS诱导的M1巨噬细胞极化促进BMSCs的成骨作用”，希望作为研究文章发表在《国际生物大分子杂志》上。提交该手稿时不存在利益冲突，所有作者均同意发表。我代表我的合作者声明
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（编号：82201009）、浙江省科技计划项目（编号：2025ZY01057）和嘉兴市公益研究项目（编号：2024AD10056）的财政支持。
