《International Journal of Biological Macromolecules》：Investigating stability landscape of Aurora kinase B probed by guanidinium chloride-induced unfolding
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AURKB的结构稳定性研究显示，通过GdmCl诱导变性结合光谱分析和分子动力学模拟，发现其存在两态 unfolding 机制，催化活性随变性剂浓度升高显著下降，为抗癌治疗提供新靶点。
Gulam Mustafa Hasan|谢旭欣|Safikur Rahman|Saba Noor|Ramesh Thiyagarajan|Faez Iqbal Khan|Md. Imtaiyaz Hassan
沙特阿拉伯阿尔-卡尔杰（Al-Kharj）萨塔姆·本·阿卜杜勒阿齐兹大学（Prince Sattam Bin Abdulaziz University）医学院基础医学科学系，邮编11942
摘要
Aurora激酶B（AURKB）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是染色体分离、细胞分裂和有序细胞分裂的关键调节因子。AURKB的结构不稳定会破坏有丝分裂进程，进而促进肿瘤发生。在本研究中，我们利用胍氯化物（GdmCl）诱导的变性方法研究了人AURKB的结构稳定性。通过远紫外圆二色性（CD）和内在色氨酸荧光光谱分析了AURKB的结构变化。光谱分析显示，AURKB在1.0 M GdmCl浓度下部分变性，在2.0 M GdmCl浓度下结构显著丧失。尽管在2.0–2.5 M GdmCl浓度下AURKB仍保留部分活性，但在更高浓度下活性完全消失。从变性曲线计算得到了稳定性参数，包括无变性剂条件下的吉布斯自由能（ΔG0D）、变性中点（Cm）以及ΔGD与[GdmCl]浓度的斜率（m）。重叠的转变曲线表明AURKB的变性过程具有两态特性（N ? D）。酶活性测定进一步表明，即使是低浓度的GdmCl也会降低AURKB的催化活性。通过分子动力学（MD）模拟研究了蛋白质变性的早期步骤。这些互补的生物物理和计算分析揭示了AURKB的结构稳定性机制，有助于理解调控激酶稳定性的因素。这项工作加深了我们对AURKB在非天然条件下的行为理解，可能为治疗策略的合理设计提供依据。
引言
蛋白激酶是一大类在生物功能中起关键作用的酶，包括细胞增殖、信号转导、细胞凋亡和代谢[1]。激酶活性的改变是多种人类疾病的特征，尤其是在癌症中，这些酶的突变或过度表达常常导致细胞增殖失控，成为多种疾病的根本原因[2],[3]。因此，为了应对这些挑战，阐明调控激酶结构稳定性和折叠的生物物理特性及构象动态至关重要，这些因素影响酶的功能和药物相互作用[4],[5]。
多种激酶抑制剂已被用于传统的治疗策略[6]，但主要受到脱靶效应、药物耐药性和对激酶结构动态理解不足的限制[7]。此外，蛋白质必须达到正确的构象状态才能表现出其活性和生物学功能，这涉及共价和非共价相互作用的复杂机制[8],[9]。某些环境因素，如pH值变化、化学应力、温度和电解质失衡，会改变蛋白质的正常生理折叠过程，从而影响其结构和功能[10],[11]。使用变性剂进行化学变性可以研究蛋白质变性和重折叠的动力学和热力学特性[12]。
GdmCl是一种众所周知的变性剂，它可以破坏蛋白质链内的非共价相互作用，有助于评估构象稳定性、变性转变和中间态的形成[13]。系统地理解蛋白质的结构完整性、催化活性和调控相互作用对于揭示激酶的结构-功能关系至关重要。与基于X射线晶体学或冷冻电子显微镜的全面结构研究不同，化学变性研究和分子动力学模拟有助于全面了解蛋白质折叠模式，从而更好地理解激酶对细胞应激、突变或治疗抑制的反应[9],[14]。
Aurora激酶B（AURKB）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，在染色体分离和细胞分裂中起关键作用[15]。AURKB是染色体乘客复合体的重要组成部分，该复合体参与多种蛋白质的磷酸化，包括p53、组蛋白H3和survivin[16]。由于其在有丝分裂纺锤体组装中的作用，AURKB被认为具有很高的致癌潜力，因此是一个重要的治疗靶点。其异常表达与多种癌症有关，包括乳腺癌、肺癌、结肠癌和前列腺癌[17]。在受控条件下研究AURKB的变性模式有助于识别对构象敏感的结构元素，从而预测其在各种病理状态下的行为[18]。GdmCl诱导的变性实验是推进激酶功能和稳定性分子理解的有价值工具，有助于开发更有效和选择性的激酶靶向疗法。
在本研究中，从细菌系统中表达了重组人AURKB蛋白并进行了纯化。通过GdmCl诱导的变性方法评估了纯化重组AURKB的构象动态变化。利用远紫外圆二色性（CD）光谱和内在荧光测量监测了GdmCl浓度增加时AURKB的结构变化。此外，还进行了激酶抑制实验以阐明不同GdmCl浓度下AURKB催化活性的变化。为了验证实验结果，我们进一步在 explicit water 中对不同GdmCl浓度下的AURKB进行了300 ns分子动力学（MD）模拟。光谱研究表明，随着GdmCl浓度的增加，AURKB发生显著变性，同时催化活性也大幅下降。这些研究结果有助于理解蛋白质在变化环境中的整体行为，还有助于研究对完全变性和重折叠至关重要的蛋白质结构序列，或易形成聚集体的序列。
材料
含有重组人AURKB基因的pet28a质粒（带有6×-His亲和标签）从Biomatik购买，并转入BL21 (DE3) 大肠杆菌细胞中。Luria Bertani肉汤、硫酸卡那霉素、Tris缓冲液、NaCl、异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、GdmCl和N-月桂基丝氨酸购自德国Sigma Aldrich/Merck Darmstadt。研究中使用了GE Healthcare Biosciences公司的Ni-NTA树脂。
人AURKB的表达与纯化
含有重组人AURKB的质粒被转入
AURKB的表达与纯化
全长约37 kDa的AURKB蛋白成功从BL21 (DE3) 细胞中表达并纯化。通过紫外-可见光谱和荧光测量，分别证实了蛋白质通过二级和三级结构的完全折叠。此外，纯化后的蛋白质中未观察到任何可见或不可见的聚集物。从1升细菌培养物中获得的蛋白质产量约为0.9–1 mg/ml。
讨论
蛋白质在受到渗透压、热或代谢压力时会发生结构变化，这在生物医学科学中是一个值得关注的问题[26]。此外，治疗性蛋白质在制药生产过程中经常面临极端的环境条件，包括pH值、高盐度和温度[27]。因此，几十年来人们进行了大量关于蛋白质稳定性的研究，以深入了解蛋白质的折叠和变性机制。
结论
本研究提供了关于GdmCl诱导变性下AURKB折叠和变性机制的宝贵见解。人AURKB被表达并纯化，其稳定性参数通过光谱探针进行了系统评估。远紫外CD和内在荧光光谱的S形转变曲线分析表明，AURKB在低GdmCl浓度下开始部分变性，在2.0 M或更高浓度下结构完全丧失。
CRediT作者贡献声明
Gulam Mustafa Hasan：撰写初稿、验证、资源提供、方法论设计、数据分析、概念构思。Yuxin Xie：撰写初稿、软件使用、方法论设计、资金获取、数据分析。Safikur Rahman：撰写与编辑、验证、监督、方法论设计、实验研究、数据分析。Saba Noor：撰写初稿、验证、资源提供、实验研究、数据分析、概念构思。Ramesh Thiyagarajan：撰写
写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
使用了人工智能（AI）工具，特别是ChatGPT（OpenAI, GPT-5），来优化语言表达、提高清晰度并改善手稿的可读性。作者确认没有使用AI工具生成原始科学内容、进行分析或得出结论。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
致谢
GMH感谢萨塔姆·本·阿卜杜勒阿齐兹大学通过项目编号（PSAU/2025/03/36712）资助了这项研究工作。
