SPHK/S1P信号通路参与调节微重力环境下成骨细胞的增殖和分化过程

《Acta Astronautica》：The SPHK/S1P signaling axis is involved in modulating osteoblast proliferation and differentiation in microgravity

空间模拟与真实微重力环境下S1P信号通路对骨细胞功能调控机制研究。通过RPM模拟和神舟空间站实验，证实激活SPHK/S1P通路可显著促进成骨细胞增殖及矿化结节形成，部分逆转微重力诱导的骨生成抑制。关键作用分子为S1P受体激动剂FTY720，其通过调节SPHK/S1P代谢平衡调控骨代谢稳态。

　　

任伟浩|王瑞|张建国|甄晨晓|刘俊宇|魏思清|王林军|杨周琦|尚鹏

西北工业大学深圳研究院，中国深圳518057

摘要

太空引起的骨质流失仍然是长期人类太空探索面临的一个重大健康挑战。在微重力条件下，成骨细胞介导的骨形成受到抑制，从而导致骨质流失；然而，其确切机制尚未完全明了。鞘氨醇-1-磷酸（S1P）是一种来自细胞膜的生物活性脂质代谢物，通过调节成骨细胞功能对维持骨代谢平衡至关重要。本研究利用随机定位机（RPM）模拟的微重力环境以及中国空间站（CSS）上的真实失重条件，观察了成骨细胞系MC3T3-E1和小鼠颅骨中分离出的原代成骨细胞（POBs）的增殖和矿化结节形成情况。同时，分析了与骨形成相关的SPHK/S1P信号分子及关键调控因子的表达水平变化。结果表明，使用S1P受体激动剂FTY720激活S1P信号通路显著促进了成骨细胞的增殖和矿化，部分逆转了微重力对骨形成功能的抑制作用。在RPM模拟的微重力条件下，FTY720处理增强了碱性磷酸酶（ALP）活性，增加了钙结节的形成，并上调了与骨形成相关的基因和蛋白质表达。进一步分析显示，微重力主要下调了S1P受体（S1P1和S1P2）和S1P激酶（SPHK1和SPHK2）的表达，同时上调了S1P磷酸酶（SPP）和S1P裂解酶（SPL）的表达。然而，外源性S1P和FTY720的给药显著逆转了这些效应。在中国空间站上的太空飞行实验进一步证实，FTY720显著增强了成骨细胞的增殖并促进了POBs的矿化结节形成。这些发现表明，SPHK/S1P信号通路是在微重力条件下调节成骨细胞增殖和分化的关键途径。

引言

在过去的几十年里，太空探索过程中，由于微重力导致的骨质流失已成为宇航员面临的主要健康问题之一[1]、[2]、[3]、[4]。先前的生理学研究表明，中长期太空飞行会显著损害骨骼系统，宇航员的月度骨量损失约为1.0%-1.5%[5]。这种情况表现为骨密度下降、骨微结构恶化、机械性能减弱、血液和尿液中钙含量升高以及骨折风险增加。宇航员承重骨中的骨质流失程度甚至可能超过绝经后骨质疏松症妇女的情况。因此，研究失重引起的骨质流失机制对于维持长期太空任务中的骨骼健康至关重要[6]。

太空引起的骨质流失主要是由于微重力改变了骨细胞（包括骨细胞、成骨细胞、破骨细胞和骨髓间充质干细胞）的形态和功能。失重环境会迅速诱导成骨细胞和破骨细胞的基因表达谱发生动态变化[7]、[8]，从而导致骨形成受到抑制而骨吸收增强，最终破坏骨代谢平衡。这些过程最终导致骨组织发生退行性结构变化和生物力学承载能力下降。成骨细胞对机械应力特别敏感，因此是卸载引起的骨骼变化中的关键细胞类型[9]、[10]。研究表明，在国际空间站上暴露于显著改变的机械环境中的成骨细胞，其细胞增殖和DNA修复过程均受到抑制[11]。在微重力条件下，成骨细胞的形态逐渐转变为多种形式，包括堆叠状、星形和分散状[9]。在航天飞机上微重力环境下培养9天的成骨细胞表现出碱性磷酸酶（ALP）和骨钙素（OCN）的mRNA水平下降，表明其分化能力明显受损[12]。另一项在航天飞机上的研究显示，微重力抑制了大鼠成骨细胞中胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的mRNA表达，破坏了IGF-1介导的信号通路[13]。

S1P信号通路最近被确认在骨质疏松症的发病机制和进展中起着关键作用[14]、[15]、[16]。鞘氨醇-1-磷酸（S1P）通过鞘氨醇激酶（SPHK）的催化作用合成，SPHK有两种亚型：SPHK1和SPHK2。体内S1P代谢的稳态调节涉及SPHK、鞘氨醇磷酸酶（SPP）和鞘氨醇-1-磷酸裂解酶（SPL）之间的协同作用。SKi II是目前研究中广泛使用的特异性SPHK抑制剂。此外，S1P和神经酰胺都是细胞生长、存活和死亡的关键调节因子[17]、[18]。S1P在细胞内作为第二信使，在细胞外作为配体发挥作用。在细胞外，它激活细胞表面的S1P受体（S1P1–S1P5），启动自分泌/旁分泌信号传导，调节多种细胞过程[19]、[20]。当前的研究表明，S1P这种生物活性鞘脂代谢物通过调节成骨细胞功能来调节骨代谢[21]。具体来说，S1P促进成骨细胞的增殖和分化，同时抑制细胞凋亡[22]。S1P与成骨细胞膜受体结合后，会激活下游信号级联反应。先前的研究表明，细胞外的鞘氨醇髓磷脂酶会提高成骨细胞中的神经酰胺水平，从而抑制Erk通路并刺激骨形态发生蛋白-4（BMP-4）介导的OCN合成，进而促进成骨细胞黏附和矿化[23]。此外，S1P与其受体结合还会诱导环氧化酶-2（COX2）的上调，导致成骨细胞中RANKL表达增加。过量的RANKL与RANK相互作用，促进破骨细胞分化，这是维持骨代谢平衡中的关键调节步骤[19]、[24]。然而，S1P信号通路在微重力引起的骨重塑失衡中的潜在作用尚未有报道。

FTY720（从一种传统中药中提取）具有免疫调节作用，可作为S1P受体调节剂。它在体内磷酸化后，其活性形式FTY720-P在结构上类似于S1P，能与S1P1受体高亲和力结合[25]。与内源性S1P引起的短暂激活不同，FTY720-P会触发S1P1受体的持续内化，随后通过泛素-蛋白酶体途径降解，导致表面S1P1受体耗竭。这一过程导致S1P-S1P1信号通路的功能拮抗，这是其免疫抑制作用的核心机制[26]。值得注意的是，越来越多的证据表明FTY720具有骨调节潜力[27]。例如，FTY720能增强BMP-2诱导的成骨细胞分化，并促进卵巢切除大鼠模型中骨髓间充质细胞的成骨分化[28]、[29]。此外，在骨缺陷模型中，FTY720通过促进M2型巨噬细胞极化和抑制破骨细胞形成来促进骨形成[30]。非选择性S1P受体激动剂FTY720的药物治疗可增加野生型小鼠的骨形成，但不会影响S1P3缺陷小鼠[31]。除了作为S1P受体调节剂外，FTY720还抑制SPHK1和SPHK2的活性，破坏S1P的代谢平衡[32]、[33]。实际上，直接证据表明，在特定条件下，FTY720可以直接抑制骨形成标志物的表达，减少基质矿化，并减轻病理性钙化[34]。这些发现表明，FTY720可能根据细胞环境的不同而具有促进或抑制骨形成的作用。FTY720能否将这些骨调节特性转化为有效策略来改善微重力条件下的成骨细胞功能障碍，仍然是一个未解决的重要问题。

本研究使用RPM模拟微重力环境，并结合中国空间站上的真实微重力条件，应用了三种外源性小分子化合物S1P、FTY720和SKi II，以研究GFP标记的MC3T3-E1成骨细胞系和原代成骨细胞（POBs）的增殖活性和分化能力。目的是评估靶向SPHK/S1P信号通路是否可以作为缓解微重力引起的骨质流失的治疗策略。

细胞培养

成骨细胞系GFP-MC3T3-E1（由澳大利亚悉尼大学ANZAC研究所的周洪教授提供）和POBs（从中国空军医科大学获得的3天大的雄性C57BL/6小鼠颅骨中分离）在α-MEM（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）培养基中培养，培养基中添加了10%的胎牛血清（FBS）。在GFP-MC3T3-E1细胞中，绿色荧光蛋白（GFP）报告基因与I型胶原启动子区域融合，以便

外源性S1P和FTY720促进成骨细胞生长

我们使用外源性S1P、S1P受体激动剂FTY720和SPHK抑制剂SKi II研究了成骨细胞中的S1P信号通路。S1P浓度在0.25至2 μM范围内，FTY720浓度在0.5至2 μM范围内时，显著增强了GFP-MC3T3-E1的增殖（图3A）。相比之下，SKi II在浓度超过10 μM时具有细胞毒性，IC₅₀为3.04 μM（图3A）。因此，在后续实验中我们使用了1 μM的三种化合物。

黏附后，GFP-MC3T3-E1成骨细胞表现出强烈的纺锤形或菱形

讨论

许多先前的研究表明，作为骨组织中的主要机械感受器，骨细胞能够感知外部机械刺激并产生生物活性物质，从而调节成骨细胞和破骨细胞的功能[37]。微重力条件可诱导骨细胞凋亡或功能退化，这些退化的骨细胞会招募破骨细胞，导致骨质流失[38]。然而，也有研究表明成骨细胞可以直接感知并响应机械刺激

结论

本研究首次确立了S1P/S1PR通路在对抗微重力引起的成骨细胞功能障碍中的关键作用，为基于S1P的疗法缓解太空飞行相关骨质流失提供了理论基础。为了推进这些发现，需要开发跨药理学、生物工程和太空生理学的多学科策略，以优化干预方案。这些努力将有助于支持深空任务中的长期骨骼健康

作者贡献声明

张建国：资源获取、实验研究。甄晨晓：可视化处理、软件应用、数据分析。刘俊宇：验证、实验研究。魏思清：实验研究。任伟浩：初稿撰写、可视化处理、实验研究、概念构思。王瑞：验证、软件应用、方法学设计、数据管理。王林军：资源获取、资金争取。杨周琦：审稿与编辑、项目监督、概念构思。尚鹏：审稿与编辑

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务或个人利益冲突，这些利益冲突可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢中国载人航天计划空间利用项目（YYWT-0901-EXP-04）和中国载人航天计划空间医学实验项目（HYZHXM01008、HYZHXM01021）的支持。