人血清白蛋白与阿立哌唑一水合物之间的相互作用促进了阿立哌唑微晶的形成：这为蛋白质介导的晶体生长抑制机制提供了证据

《Chemical Engineering Science》：Human serum albumin–aripiprazole monohydrate interactions promote microcrystal formation of aripiprazole: mechanistic evidence for protein-mediated suppression of crystal growth

HSA有效调控阿立哌唑单水合物晶体形态与尺寸，通过氢键网络抑制晶体生长并诱导微晶形成，分子动力学模拟证实其结合自由能随HSA浓度增加显著升高。

　　

Jierui Huo|Shujin Liao|Xinyu Liu|Jianping Wang|Liyin Liang|Qiaomei Sun|Jie Bai|Suqing Zhao|Kailin Xu

广东工业大学生物医学与药学科学学院，广州510006，中国

摘要

药物化合物的晶体习性和大小是影响下游加工和治疗效果的关键因素。本研究证明，人血清白蛋白（HSA）能够有效调节阿立哌唑一水合物（APZM）的晶体习性，减小其晶体尺寸，并诱导其微晶化。光学显微镜和扫描电子显微镜观察结果显示，当与高浓度的HSA相互作用时，APZM的晶体尺寸会减小，形成1～2微米的微米级晶体。X射线衍射、热分析、傅里叶变换红外光谱以及Rietveld精修技术共同证实了APZM的形成。共聚焦荧光成像进一步验证了HSA与APZM晶体的结合。在较高浓度的HSA作用下，HSA与APZM的相互作用增强，APZM的晶体生长受到更显著的抑制。分子动力学模拟表明，在APZM浓度恒定的情况下，增加HSA的数量会导致绝对结合自由能增加（从-1859.0千卡/摩尔增加到-4113.3千卡/摩尔），氢键数量增加（从127个增加到374个），相互作用能量增强（从-12.5×10^3千焦/摩尔增加到-32.4×10^3千焦/摩尔），均方根波动（RMSF）增大（从0.24纳米增加到0.46纳米），平均平方位移（MSD）减小（从176.4埃^2减小到5.7埃^2）。这些发现表明，HSA通过密集的氢键网络捕获APZM分子，限制其扩散，并阻止溶质向晶体核心的传输，从而重塑晶体习性并抑制晶体生长，实现微晶化。这一机制赋予HSA高效、环保且安全的晶体习性调节功能，为药物微晶化提供了一种新的生物衍生策略。

引言

药物晶体的物理化学性质——多晶型、晶体习性和颗粒大小——决定了药物的溶解度、稳定性、生物利用度和机械性能，进而决定了药品的最终质量（Taylor等人，2021年；Pu和Hadinoto，2024年）。其中，晶体习性和大小对药物的下游加工和治疗效果至关重要。因此，阐明决定晶体习性改变的机制对于药品的稳健开发和质量保证至关重要（Wang等人，2016年；Bourcier等人，2016年）。在药物结晶过程中，添加剂可以有选择地调节晶体习性和大小（Zhang等人，2020年；Gupta等人，2019年）、生长速率（Chen等人，2023年）和形态（Hebel等人，2013年）；然而，它们发挥这种控制的分子级机制仍需进一步深入研究。因此，系统地研究添加剂如何调节药物晶体习性和大小是必要的。

目前，溶剂结晶添加剂主要包括：离子型（Smith，2015年）；小分子型（Sun等人，2019年）、大分子型（Zhang等人，2020年；Chen等人，2023年；Qiu等人，2025年；Mohapatra等人，2017年；Kumar等人，2015年；Kuldipkumar等人，2005年；Hatcher等人，2020年）以及定制型添加剂（Kaskiewicz等人，2021年；Black等人，2018年）。其中，大分子添加剂作为晶体习性调节剂特别有效，因为它们良好的空间位阻效应可以阻止溶质吸附位点，阻碍特定晶面的生长，从而影响成核和生长动力学（Pu和Hadinoto，2024年；Zhang等人，2020年；Huang等人，2017年；Alonzo等人，2012年）。蛋白质是药物研究领域中的重要大分子，它们可以与药物分子强烈相互作用（Gan等人，2018年）。蛋白质具有复杂的空间结构，并表现出明显的空间位阻效应。它们众多的药物结合位点可以显著影响药物结晶过程，进而影响晶体结构。此外，蛋白质环保、无污染且安全，是药物结晶中大分子添加剂的理想选择（Xu等人，2023年；Soares等人，2024年；Shahlaei等人，2015年；Rabbani和Ahn，2019年）。人血清白蛋白（HSA）是一种广泛用于蛋白质-药物相互作用研究的模型蛋白，可以与多种药物形成强相互作用（Gan等人，2018年）。在本文中，将使用HSA作为药物结晶添加剂，探讨其对药物晶体习性的调节作用。

目前有许多研究表明HSA具有多个可以与阿立哌唑相互作用的位点。本研究选择阿立哌唑作为模型药物，研究蛋白质对药物结晶调节的作用及其机制。阿立哌唑是一种非典型抗精神病药物，也被称为多巴胺系统稳定剂，广泛用于治疗精神分裂症、双相情感障碍和难治性抑郁症，具有明确的疗效和良好的耐受性（Piotr，2012年；Karkare等人，2023年；Bonacorsi等人，2006年）。大量研究揭示HSA具有多个与阿立哌唑的结合位点，并初步研究了相互作用特性和关键结合残基（Sakurama等人，2019年；Sakurama等人，2020年；Sakurama等人，2018年）。这些研究还扩展到了HSA-阿立哌唑与添加剂的三元相互作用或生理复杂性的模拟（Yan等人，2015年；Nishi等人，2021年）。然而，这些研究主要集中在溶液相的分子水平。基于这些发现，我们进一步探讨了蛋白质-药物相互作用介导的药物结晶的固态结构和潜在机制。本研究证明HSA与阿立哌唑之间的相互作用显著影响了阿立哌唑一水合物（APZM）的结晶。通过研究HSA-阿立哌唑/异丙醇溶液的结晶系统，探讨了药物-蛋白质相互作用在驱动药物结晶变化中的作用，并从晶体学角度阐明了蛋白质调节的结晶机制。同时，利用分子对接和分子动力学模拟，系统地研究了APZM与HSA在微观水平上的相互作用机制。

为了更深入地理解HSA与APZM之间的相互作用机制，分子建模是理解这些分子之间相互作用的宝贵工具（Gupta等人，2019年；Yin等人，2011年）。目前，有多种计算方法用于生物分子系统的研究，包括分子动力学（MD）模拟、蒙特卡洛（MC）方法、密度泛函理论（DFT）和粗粒化分子动力学（CGMD）模拟（Bourcier等人，2016年；Zhang等人，2020年；Weber等人，2025年；Olowookere和Turner，2025年；Chen等人，2025年）。其中，GROMACS软件在MD模拟中可以可视化原子运动轨迹并捕捉动态过程（Khan等人，2024年；De Vivo等人，2016年）。在进行GROMACS计算时，可以定量计算热力学和动力学参数，同时实现高保真的模拟条件。这对于通过模拟研究药物-靶蛋白相互作用至关重要（Zhu等人，2024年；Lindorff-Larsen等人，2010年；Kimura等人，2017年；Galano-Frutos和Sancho，2024年）。

在本研究中，所有模拟均使用GROMACS软件进行（蛋白质优化也在GROMACS中进行）。GROMACS与多组分系统具有良好的兼容性，并支持经典力场，如AMBER（Lee等人，2016年）、CHARMM（Kim等人，2017年）和OPLS-AA/L（Dodda等人，2017年），这些力场为大分子提供了精细调整的参数优化。本研究采用了适用于晶体学的AMBER14SB ff99SB力场（Tian等人，2020年）。MD计算能够通过高保真建模定量评估热力学和动力学参数。GROMACS预测分子轨迹，提供详细的行为洞察和准确的结果。与以往专注于晶体表面单层模型的研究不同（Valdes-Tresanco等人，2021年；Kharazian等人，2021年；Kawai等人，2022年），我们开发了一个综合的大分子-药物复合模型，更真实地代表了实际系统。首先建立了一个不含大分子的对照组，然后在此基础上构建了单个大分子系统和多个大分子系统，系统地研究大分子对药物分子的影响。

本研究的主要目的是阐明HSA如何调节APZM的晶体习性变化，并为药物结晶中大分子添加剂的选择及其调节机制提供理论支持。通过倒置显微镜和扫描电子显微镜（SEM）监测晶体习性和大小的变化。粉末X射线衍射（PXRD）、差示扫描量热-热重分析（DSC-TGA）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析和Rietveld精修技术共同证实了阿立哌唑一水合物APZM的形成。随后，可视化了HSA介导APZM晶体习性变化的方式，进一步阐明了这种调节机制。通过长期MD模拟进一步探讨了HSA调节晶体习性的机制。分析了对照组的堆积机制，并计算了HSA与APZM之间的相互作用能量以及潜在的氢键模式，确认了大分子与药物之间的强相互作用。将相互作用位点的均方根波动（RMSF）分析与分子对接结果进行比较，以确定关键结合区域。最后，在微观水平上展示了模拟过程中APZM的平均平方位移（MSD），证明HSA对APZM的结晶习性具有显著的调节作用。

材料

阿立哌唑（纯度≥99.0%）由辽宁库克生物有限公司提供。HSA（纯度96～99.0%，分子量约66.5 kDa）由元业生物科技有限公司提供。异丙醇及其他所有溶剂和试剂（分析级）均购自Sigma-Aldrich（上海，中国）。所有化学品均按接收状态使用，无需进一步纯化。

结晶实验

将90毫克阿立哌唑溶解在15毫升异丙醇中，将18毫克HSA溶解在15毫升超纯水中（最终HSA浓度...）

HSA介导的APZM结晶

图1显示了在不同HSA浓度下制备的APZM晶体的倒置显微镜和SEM图像。HSA介导的结晶策略显著改变了APZM的晶体习性并减小了颗粒大小。空白组和实验组之间的比较显示，空白组中的晶体明显较大。当HSA浓度升高到0.60毫克/毫升时，HSA与APZM的相互作用增强：许多小晶体出现在主晶粒附近...

结论

总之，基于HSA与阿立哌唑之间的相互作用，将HSA引入阿立哌唑结晶系统成功诱导了APZM晶体习性的变化，且随着HSA浓度的增加，晶体尺寸显著减小。此外，当HSA浓度超过0.60毫克/毫升时，结晶系统中形成了1～2微米的APZM微晶，表明HSA对APZM晶体习性的影响更为显著...

CRediT作者贡献声明

Jierui Huo：数据整理、研究、方法论、初稿撰写。Shujin Liao：研究、方法论、初稿撰写。Jianping Wang：研究、方法论。Xinyu Liu：概念化。Liyin Liang：概念化。Jie Bai：方法论、资源准备、验证。Qiaomei Sun：撰写、审稿与编辑。Suqing Zhao：方法论、监督。Kailin Xu：概念化、数据整理、正式分析、方法论、项目管理、资源准备、撰写

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：22108041）和广东省自然科学基金（项目编号：2020A1515010952和202201010133）的支持。