《ACS Sensors》：High-Throughput Human Histone Detection by an Engineered Actinoporin Nanopore
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本文报道了一种基于珊瑚来源肌动孔蛋白同系物Fav（Fav nanopore）改造而成的纳米孔（RN1-Fav）。研究者成功将其稳定整合至商用MinION设备的聚合物膜中，实现了无需标记、实时、高通量的全长人组蛋白及其翻译后修饰（PTMs）变体的单分子检测与鉴定。该工作通过高通量电生理表征、电流阻断分析和机器学习算法，能够区分并定量生物医学上重要的胞外组蛋白（如H4和H3Cit），是推动纳米孔技术在蛋白质组学分析和疾病生物标志物检测中广泛应用的重要一步。
基于工程化Fav肌动孔蛋白纳米孔实现高通量人组蛋白检测
1. 野生型Fav孔在脂质膜与聚合物膜中稳定插入的优化
研究者最近描述了一种来自珊瑚Orbicella faveolata的新型肌动孔蛋白同系物（野生型Fav， wtFav）形成的圆锥形孔。与来自海葵Actinia fragacea的肌动孔蛋白毒素fragaceatoxin C（FraC）类似，wtFav孔结构包含两个区域：位于膜cis侧、由原体圆形排列的β-三明治形成的“帽”结构，以及每个原体贡献单个α-螺旋形成的跨膜区域。与FraC相比，wtFav在脂质双层的trans侧有一个额外的82个氨基酸长的非结构化N端延伸。然而，这个长长的非结构化N端可能抑制了wtFav孔在商用MinION设备的聚合物膜中的有效插入。
为了解决这个问题，研究团队构建了一系列具有不同N端缺失的Fav变体。其中，缺失前67个氨基酸的ΔN67Fav变体在插入聚合物MinION膜的效率方面表现最佳。最短的变体ΔN75Fav（长度对应FraC）在低于-100 mV的负电压下表现出不稳定的电流和较高的噪声，且在聚合物膜中的插入可能较弱。所有测试的变体在-90 mV电压下都显示出开放孔电流的广泛分布，这阻碍了单孔实验的进行。
为了改善孔的插入效率、开放孔电流分布和基线信噪比，研究者利用wtFav孔的3D结构，通过定点突变技术引入了点突变。在测试的多个突变体中，一个称为RN-Fav的变体显示出在负电压下稳定且离散地插入脂质双层，并显著改善了基线信噪比。RN-Fav从R77开始，长度接近FraC，并携带两个带电非保守氨基酸的突变：D203R和D215N。
在此基础上，研究团队设计出了最终的工程化变体RN1-Fav。它在ΔN67Fav的基础上，引入了RN-Fav的D203R和D215N突变，并将非结构化N端中所有带正电荷的残基替换为带负电荷或极性的残基。此外，RN1-Fav在跨膜α-螺旋区域引入了四个芳香族侧链氨基酸取代，试图减少螺旋间的间隙，这些间隙是脂质结合和潜在离子/小分子进入的位点。
与主要形成八聚体孔的FraC不同，wtFav可寡聚化为八聚体和部分九聚体孔。引入的突变改变了RN-Fav和RN1-Fav变体的八聚体/九聚体比例。通过离子交换色谱可以获得均质的八聚体或九聚体孔制备物。冷冻电镜结构解析显示，引入的D203R突变能够在孔“帽”区外侧面相邻原体之间形成额外的氢键，从而稳定寡聚体结构。芳香族残基的引入减少了跨膜区域的间隙面积，并可能通过与脂质的额外相互作用稳定螺旋束，从而降低噪声。RN1-Fav孔的孔径（八聚体1.47 nm， 九聚体1.84 nm）和内部表面电荷分布与FraC孔（1.22 nm， 内表面负电荷较少）和wtFav孔（1.54 nm， 内表面负电荷较多）均不同。
2. RN-Fav和RN1-Fav孔相较于ΔN67Fav孔的改进特性
为了进行高通量表征，研究者将Fav孔变体稳定插入MinION聚合物膜。对ΔN67Fav、RN-Fav和RN1-Fav孔在MinION流通池中的比较表征显示，RN-Fav和RN1-Fav的改进带来了显著的性能提升：
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电流分布更窄：与ΔN67Fav孔宽泛无峰的电流分布相比，RN-Fav和RN1-Fav孔的开放孔电流分布更集中。
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电流-电压（I/V）曲线形状改变：ΔN67Fav孔的I/V曲线高度不对称，在负电位下电流高且噪声大，在正电位下几乎关闭。RN-Fav和RN1-Fav孔的I/V曲线更加线性，且在正电位下的电流增大。这归因于N端的改造减少了孔在正电压下的堵塞。
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基线信噪比显著提高：在-50 mV下，RN1-Fav孔的基线信噪比（定义为平均开放孔电流除以其标准差）显著优于ΔN67Fav和RN-Fav孔。这得益于N端电荷分布的改变对孔道内质子化的影响，以及跨膜螺旋束的稳定化改造。尽管与β-桶状孔（如溶血素lysenin）相比，由α-螺旋束构成的RN1-Fav孔由于跨膜区域更灵活而噪声较高，但其改进的开放孔电流分布、更高的负电压开放孔电流、显著提升的基线信噪比，以及平均每个MinION流通池可检测到约325个单孔（占所有检测到孔信号的膜的40%），使其成为高通量蛋白质检测和鉴定的有希望的候选者。
3. 组蛋白在RN1-Fav孔中的捕获
研究选用八聚体RN1-Fav孔（因其单孔插入数量更高且制备物更均一）来检测和鉴定人组蛋白变体。组蛋白是高度带正电的蛋白质，其无序的N端尾部易发生多种翻译后修饰（PTMs），如乙酰化和瓜氨酸化。研究者假设，带负电荷的RN1-Fav孔能够根据其净电荷差异，区分带正电荷的人组蛋白变体，包括全长组蛋白H3.1、H4及其PTM变体（H3K9ac、H3K23ac、H3Cit）。
实验在负电压下进行，因为电泳力有助于将带正电的组蛋白捕获到带负电的孔道内。组蛋白的捕获在低于-30 mV的电压下即已开始。在-40 mV和-50 mV下，较小的组蛋白H4在大多数孔中产生清晰的离散电流阻断。在更高电压（如-90 或 -100 mV）下，则观察到长时间的阻断和强烈的电流波动，这可能是由组蛋白易位和/或孔道不稳定引起。更大、带正电更多的组蛋白H3.1在较低电压下就出现长时间的孔占据。因此，选择-50 mV作为记录组蛋白捕获的工作电压，以在可区分的阻断信号和良好的信噪比之间取得平衡。相比之下，FraC孔在MinION膜中的插入效率较低、不稳定，并且在H4存在下未观察到电流阻断，这表明组蛋白与RN1-Fav的相互作用得益于其独特的结构特性和净电荷兼容性。
4. RN1-Fav孔能够鉴定人组蛋白变体
在-50 mV电压和2 μM组蛋白存在下，不同组蛋白变体引起了不同的电流变化模式：
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H3.1（净电荷最高， +19.4）：导致电流几乎完全降低，伴随一些短暂的孔开放。
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H3K23ac：模式与H3.1类似，但短暂的孔开放更频繁。
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H3K9ac 和 H3Cit：不出现长时间的孔关闭。H3K9ac导致更高的电流噪声和离散的电流变化；H3Cit产生清晰的离散变化。
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H4（尺寸最小）：产生明显的离散电流阻断。
通过计算存在分析物时单个孔在60秒内的归一化平均电流及其标准差，研究者进行了批量分析。归一化平均电流大致与组蛋白的净电荷相关：H3.1最低，H4和H3Cit较高。不同组蛋白在“归一化平均电流 vs. 电流标准差”的散点图上可以被区分开。这种差异表明，阻断信号很可能源于组蛋白无序N端尾部与孔道内表面之间的特异性序列相互作用。乙酰化（如H3K9ac）减少尾部正电荷，导致更多离散变化并减少长时间的孔关闭。对同一孔顺序添加不同组蛋白的实验进一步证实了每种组蛋白与孔的相互作用模式不同，且组蛋白可通过反向电压极性下的缓冲液冲洗有效去除。
5. 电流阻断分析可区分医学相关的组蛋白
对电流阻断事件的详细分析（提取幅度、阻断噪声和停留时间等参数）能够更精确地区分组蛋白。以医学上重要的胞外组蛋白H4和H3Cit为例：
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H4：引起最高的阻断幅度（0.83 ± 0.10）和较低的阻断噪声，停留时间较短。因其尺寸较小，可能被捕获到孔道更深处，更阻碍电流。
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H3Cit：阻断幅度较小（0.38 ± 0.08），阻断噪声较高，停留时间较长。可能由于其净正电荷较低，所受电泳力较小。
基于阻断幅度、噪声和停留时间的三维散点图可以清晰区分这两种组蛋白。此外，阻断频率（1/τON， 阻断间隔时间的倒数）与组蛋白浓度（0.5-4 μM）呈线性相关，表明RN1-Fav孔也可用于组蛋白的定量检测。
6. RN1-Fav孔允许在混合物中区分医学相关的胞外组蛋白
为了模拟真实生物样本中多种组蛋白共存的情况，研究者利用机器学习来分析混合物中的阻断事件。使用从纯H4和H3Cit样本中提取的阻断参数（幅度、噪声、停留时间）训练k-最近邻（kNN）模型，分类准确度达0.979。随后，将模型应用于不同摩尔比（1:0， 3:1， 1:1， 1:3， 0:1）的H4/H3Cit混合物（总浓度2 μM）数据。模型能够对混合物中的阻断事件进行分类，并根据分类为H4或H3Cit的阻断数量比例，准确估算出混合物中H4的比例，且与实际比例呈良好的线性关系。这证明了RN1-Fav孔结合机器学习方法，具备在复杂混合物中鉴定和定量特定组蛋白变体的潜力。
7. 结论
本研究成功开发了一种基于珊瑚Orbicella faveolata肌动孔蛋白同系物改造而成的RN1-Fav蛋白质纳米孔。该孔能够稳定插入MinION设备的聚合物膜，实现了高通量检测。RN1-Fav孔以其圆锥形状和独特的负电荷分布，丰富了现有的纳米孔工具箱，能够无需预先解折叠即可实现带正电分析物（如组蛋白）的无标记捕获和区分。
研究证明，RN1-Fav孔与MinION平台结合，无需复杂样本前处理，即可实现全长人组蛋白及其翻译后修饰变体的检测与区分。通过批量分析、详细的电流阻断分析和机器学习算法，能够区分并定量像H4和H3Cit这样生物医学上重要的胞外组蛋白。这项工作为开发快速、准确的单分子方法，用于实时监测人体样本中的组蛋白，迈出了新的一步，展现了纳米孔技术在蛋白质组学分析和疾病生物标志物检测中的应用前景。
