利用京尼平交联MANAE-琼脂糖固定化棘孢曲霉FTase：提升低聚果糖产量与稳定性的创新策略

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Innovative Immobilization of Aspergillus aculeatus OI4C2 Fructosyltransferase on MANAE-Agarose Cross-Linked with Genipin for Enhanced Production of Fructooligosaccharides

本文介绍了将棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus) OI4C2来源的果糖基转移酶(FTase)固定于京尼平(genipin)交联的单氨-N-氨基乙基(MANAE)-琼脂糖上的创新方法。研究表明，该方法实现了高达98.53%的固定化效率，显著增强了酶在40-60℃及酸性pH (4.5-6.5)下的稳定性。与游离酶相比，固定化酶的连续使用12次后仍保留50%活性，其低聚果糖(FOS)产量也提升至97.37 g L–1，且产物主要为短链FOS（1-蔗果三糖(GF2)和果糖基蔗果三糖(GF3)）。该研究为食品和医药工业提供了一种更稳定、可重复利用且环境友好的生物催化剂，对于大规模、可持续的FOS生产具有重要意义。

　　

引言

果糖基转移酶(FTase, E.C. 2.4.1.9)和一些β-呋喃果糖苷酶(FFase, E.C. 3.2.1.26)能够催化蔗糖水解并将其果糖基部分转移到另一个蔗糖分子上，从而生成低聚果糖(FOS)，主要包括1-蔗果三糖(GF2)、果糖基蔗果三糖(GF3)和果糖基蔗果四糖(GF4)。FOS因其能够被肠道有益微生物选择性发酵及其相关的健康促进作用而备受重视，被广泛认为是功能性食品或益生元。它们具有低热量、对糖尿病患者安全以及降低血液甘油三酯和总胆固醇的潜力。

目前，大规模生产FOS最常用的方法是菊粉的酸水解法，但该方法存在选择性差、副产物多、产生化学废料等问题。相比之下，利用FTase以蔗糖为底物酶法生产FOS具有经济优势，但其工业应用仍受限于酶在pH、温度和压力变化下的不稳定性，以及酶回收和再利用的挑战。酶固定化已成为克服这些限制的有效策略，它能提高酶的稳定性，实现连续系统中重复使用，从而降低运营成本。其中，使用天然交联剂（如从美洲格尼帕Genipa americanaL.提取的京尼平）作为一种环保、低细胞毒性的交联剂，比传统的戊二醛更具优势。本文旨在研究将棘孢曲霉OI4C2 FTase固定于京尼平交联的MANAE-琼脂糖上，并评估其生化特性、操作稳定性以及在蔗糖生产FOS中的效率。

材料与方法

研究使用了来自巴西福斯杜伊瓜苏贝拉维斯塔生物保护区的棘孢曲霉(A. aculeatus) OI4C2菌株。FTase通过离子交换层析(DEAE-Sephadex)和凝胶过滤层析(Sephadex G-75)进行纯化，其纯化倍数达5.6倍，回收率为38.8%，比活性高达40,371.7 U mg^–1。酶均一性通过SDS-PAGE和酶谱分析证实，显示为一条约110 kDa的单一蛋白条带。

MANAE-琼脂糖支持物通过与京尼平在pH 7.0条件下孵育进行交联制备。纯化的FTase以5 μg/g支持物的比例在pH 5.5的醋酸钠缓冲液中固定化16小时。固定化效率(EI)、固定化产率(YI)和活性回收率(AR)等参数均被计算。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)对支持物进行结构表征，确认了氨基与京尼平之间形成了席夫碱（亚胺键）。酶学性质表征包括最适温度与pH、热稳定性与pH稳定性、米氏动力学参数测定，以及操作稳定性评估。FOS的合成反应在55℃下进行长达36小时，产物通过高效液相色谱(HPLC)进行定量分析。

结果与讨论

FTase固定化

棘孢曲霉OI4C2 FTase在MANAE-京尼平支持物上实现了高效固定化，固定化产率(YI)达98.53%，活性回收率(AR)为76.71%，总体固定化效率(EI)为77.86%。与使用戊二醛等传统交联剂相比，京尼平作为一种天然、安全的交联剂，为食品和制药应用提供了更优的选择。

游离与固定化FTase的生化特性比较

温度效应：游离与固定化FTase的最适活性温度曲线相似，但固定化酶在20-60℃范围内的活性略低于游离酶，其最适温度向高温偏移了10℃，达到70℃。这种偏移可能归因于多点共价键合赋予的刚性结构，在温和条件下限制了构象灵活性，但在高温下延缓了热变性。在热稳定性方面，固定化FTase在40℃和50℃下孵育12小时后，显示出比游离酶更高的稳定性。然而，在70℃的高温下，其半衰期缩短至约4小时。这表明固定化策略在中等温度下提高了酶的稳定性，但在极端高温下酶更容易失活。

pH效应：游离酶和固定化酶的最适pH均为5.5。固定化FTase在pH 4.5–6.5的范围内孵育72小时后，仍能保持约70%的初始活性，表现出显著优于游离酶的耐酸性。这归功于MANAE-京尼平基质创造的微环境，为酶在酸性条件下提供了保护，减少了催化位点的失活。这种增强的酸稳定性对于许多在低pH条件下运行的食品工业过程具有重要意义。

动力学参数：以蔗糖为底物时，游离FTase的表观米氏常数(K_M,app)为0.82 M，而固定化酶为0.94 M。游离酶的最大反应速率(V_max,app) (131,926 μmol min^–1mg^–1)也远高于固定化酶 (16,129 μmol min^–1mg^–1)。这表明固定化可能限制了底物传质并降低了催化位点的灵活性，从而导致表观催化效率降低。

操作稳定性：固定在MANAE-京尼平上的FTase显示出优异的可重复使用性。在第二个和第三个反应循环后，分别保留了86.06%和83.49%的初始活性。经过12次连续使用后，其残余活性仍能保持在48%。这种出色的操作稳定性极大地降低了FOS生产的运营成本，提高了工艺的经济可行性。

FOS合成

HPLC分析显示，固定化FTase在36小时内可将蔗糖转化为97.37 g L^–1(转化率40.34%)的FOS，其中包含80.17 g L^–1的1-蔗果三糖(GF2)和17.20 g L^–1的果糖基蔗果三糖(GF3)。相比之下，在相同条件下，游离FTase仅产生73.44 g L^–1(27.04%)的FOS。反应开始30分钟后即可检测到1-蔗果三糖(GF2)的生成，果糖基蔗果三糖(GF3)则在12小时后出现。整个反应过程中蔗糖浓度持续下降，而果糖水平始终很低，表明酶具有很高的转果糖基活性，且产物主要为短链FOS。

结论

本研究成功地将棘孢曲霉OI4C2的果糖基转移酶(FTase)高效固定于京尼平(genipin)交联的MANAE-琼脂糖上，开发出一种稳定、可重复使用的生物催化剂，用于生产低聚果糖(FOS)。该固定化策略获得了高固定化产率和活性回收率，显著提升了酶在中等温度范围和酸性pH条件下的稳定性，并在多次重复使用中保持了优异的操作稳定性。更重要的是，固定化酶相较于游离酶表现出更高的FOS产量，并倾向于合成具有高食品和营养品应用价值的短链FOS（主要是1-蔗果三糖(GF2)和果糖基蔗果三糖(GF3)）。京尼平作为一种无毒的天然交联剂，突出了该固定化体系的可持续性和安全性。这些结果为MANAE-京尼平固定化果糖基转移酶在工业规模FOS生产中的应用奠定了坚实基础，并为后续的工艺优化和放大研究提供了有力支持。