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作为编辑，我推荐这篇研究：该工作通过比较转录组学发现新型O1 El Tor霍乱弧菌谱系在毒力诱导（AKI）条件下呈现独特的转录特征，并鉴定出保守基因VC1123。功能研究表明，VC1123缺失通过上调外膜孔蛋白OmpU、下调OmpT（不依赖经典ToxR/ToxS通路）显著增强菌株在乳鼠肠道中的定植能力，揭示了一个此前未被充分认识的毒力调控层，为理解新兴谱系的适应策略提供了新视角。
引言
霍乱是由霍乱弧菌（Vibrio cholerae）引起的严重肠道传染病。根据世界卫生组织数据，2024年全球60个国家报告了超过56万病例和6000余例死亡。霍乱弧菌为革兰氏阴性菌，天然存在于水生环境并通过口服途径感染，依赖毒素共调菌毛（TCP）在小肠上皮定植。其主要毒力因子霍乱毒素（CT）由ctxA和ctxB基因编码，位于CTXφ噬菌体上。TCP与CT的表达受ToxR/ToxS转录激活系统协同调控。此外，ToxR还独立调节两种外膜孔蛋白：激活ompU转录并抑制ompT。这两种孔蛋白均与肠道定植相关。
体外研究毒力基因诱导常用AKI培养系统，其通过模拟小肠的低氧、碳酸氢盐、pH和渗透压等关键物理化学信号，有效激活霍乱弧菌的毒力调控网络。
尽管已鉴定出200多种霍乱弧菌血清群，但只有产毒O1和O139血清群引起了流行性霍乱。近年来，中国发现了一种与第七次大流行株遗传不同的新型O1 El Tor霍乱弧菌谱系，并与腹泻暴发相关。本研究旨在通过比较转录组学和功能分析，揭示该新型谱系的毒力相关决定因素。
材料与方法
本研究使用的菌株包括第七次大流行株N16961（血清群O1，El Tor生物型，ctxAB+）、其等基因缺失突变体N16961-ΔVC1123、回补菌株N16961-ΔVC1123/cVC1123，以及来自新型谱系的两个分离株VC6050（血清群O1，ctxAB+）和VC6055（血清群O1，ctxAB-）。
为研究大流行株和新兴谱系对毒力诱导条件的转录反应，对在AKI培养基（毒力诱导）和标准LB肉汤（对照）中培养的N16961、VC6050和VC6055进行了RNA测序。使用AKI诱导方案：细菌先在37°C静置培养4小时至OD600约为1.0，然后在摇动条件（200 rpm，37°C）下继续培养6小时以诱导毒力基因表达。
使用TRIzol?试剂从AKI和LB培养基中生长的细菌培养物中提取总RNA，并按照先前实验流程去除基因组DNA。所有实验均使用三个独立的生物学重复。使用DESeq2鉴定条件间的差异表达基因（DEGs），并进行KEGG通路富集分析。
通过等位基因交换使用自杀载体pWM91在亲本菌株N16961中构建了VC1123的框内缺失突变体。对于遗传回补，将完整的VC1123开放阅读框（ORF）克隆到载体pSRKKtc中，并电转入N16961-ΔVC1123，产生回补菌株。
在5-6日龄C57BL/6新生乳鼠中进行定植竞争实验。将野生型N16961与突变体或回补菌株以1:1比例混合后灌胃接种。24小时后处死小鼠，取小肠进行均质化、系列稀释和平板计数，并计算竞争指数（CI）。还使用数字PCR（dPCR）对细菌载量进行定量。
为评估VC1123缺失是否影响胆汁盐耐受性，将N16961和N16961-ΔVC1123在补充了不同浓度胆汁盐的LB培养基中培养，并比较生长情况。
结果
毒力诱导（AKI）与非诱导（LB）条件下霍乱弧菌菌株的转录组分析
与LB对照相比，AKI培养在所有三个菌株中诱导了广泛的基因表达变化：在N16961、VC6050和VC6055中分别鉴定出958、966和999个DEGs。
在N16961中，DEGs显著富集于霍乱弧菌感染、氨基糖和核苷酸糖代谢、果糖和甘露糖代谢、糖酵解/糖异生以及生物膜形成等通路。在VC6050菌株中，DEGs主要富集于双组分系统、细菌趋化性、核糖体、鞭毛组装和ABC转运蛋白等通路。对于VC6055菌株，DEGs富集主要见于双组分系统、细菌趋化性、核糖体、嘧啶代谢和氮代谢等通路。
值得注意的是，细菌趋化性和生物膜形成通路在AKI条件下在所有三个菌株中持续下调。关键的趋化性基因（包括cheW、cheR、cheB、cheD、mcpH和cher2）显示出显著的转录抑制。相反，典型的毒力决定因子被上调：tcpA在所有菌株中被诱导，而霍乱毒素基因ctxAB、紧密连接毒素基因zot和辅助霍乱肠毒素基因ace在产毒菌株N16961和VC6050中特异性上调。
AKI条件下菌株间的比较分析
在AKI培养基中对三个菌株进行的成对比较揭示了广泛的转录差异：N16961对VC6050有695个DEGs；N16961对VC6055有1000个DEGs；VC6050对VC6055有220个DEGs。
与N16961 AKI组相比，AKI培养的新型谱系菌株VC6050和VC6055共有342个DEGs，这些基因在双组分系统、细菌趋化性和生物膜形成方面显著富集。当仅比较产毒菌株（N16961和VC6050）与非产毒VC6055时，共有84个DEGs，并在鞭毛组装和胆汁分泌通路中富集。
特别关注AKI条件下VC6050与N16961的比较，我们发现VC6050中有301个基因上调和394个基因下调。这些DEGs主要与细菌趋化性、生物膜形成和双组分信号传导相关。重要的是，趋化性和生物膜相关基因的下调幅度在VC6050中大于N16961。
VC1123缺失增强霍乱弧菌在乳鼠肠道中的定植能力
基因VC1123在所有三个菌株（N16961、VC6050和VC6055）中高表达，基于以下几个考虑因素被选择进行功能表征：VC1123是霍乱弧菌中一个540-bp的开放阅读框，编码一个包含未知功能结构域（DUF）的蛋白；VC1123在霍乱弧菌分离株中高度保守；其在毒力诱导条件下在新谱系分离株和第七次大流行参考菌株中的持续高表达表明VC1123可能参与与宿主适应相关的核心过程。
尽管尝试在新型谱系菌株VC6050和VC6055中构建VC1123缺失突变体未成功，但在N16961背景中成功获得了VC1123缺失突变体（N16961-ΔVC1123）和回补菌株（N16961-ΔVC1123/cVC1123）。
在5-6日龄C57BL/6新生乳鼠中进行的竞争性感染实验显示，与野生型菌株相比，ΔVC1123突变体的肠道定植能力 consistently 增强了86.34倍。相比之下，回补菌株显示出与野生型相当的定植水平，平均CI为1.06，表明VC1123负调控肠道定植。
体外生长动力学比较显示，在有氧和厌氧条件下，突变体与野生型菌株的生长速率无显著差异，表明定植增强并非由于肉汤培养中细菌适应性的改变。
为探索该表型的分子基础，我们对在LB培养基中培养至对数中期（5小时）的N16961和N16961-ΔVC1123进行了RNA测序。VC1123的缺失不影响邻近基因（VC1120–VC1125）的转录，表明对周围基因的极性效应最小。差异表达分析鉴定出突变体相对于野生型有174个DEGs，其中152个上调，22个下调。KEGG通路富集显示这些DEGs主要与群体感应、铁载体基非核糖体肽的生物合成和生物素代谢相关。
值得注意的是，外膜蛋白基因ompU在ΔVC1123菌株中 dramatically 上调（315.6倍），而ompT下调（8.47倍）。相比之下，毒力相关调节因子toxR和toxS的表达没有显著变化。此外，relB和转座酶orfAB亚基A显著下调（分别为90.9倍和66.67倍）。
参与群体感应的基因，包括ABC转运蛋白通透酶蛋白、ABC转运蛋白ATP结合蛋白、肽ABC转运蛋白通透酶蛋白和肽ABC转运蛋白ATP结合蛋白显著上调，平均增加2.74倍。此外，多个通过弧菌素生物合成进行铁获取的关键基因被显著诱导。
胆汁盐耐受性实验表明，与N16961菌株相比，N16961-ΔVC1123在0.3%和0.5%的胆汁盐浓度下表现出明显的生长优势。
RT-qPCR分析进一步验证，在AKI培养条件下，与野生型菌株相比，VC1123缺失突变体中ompU显著上调，而ompT显著下调，这与LB培养基中的观察结果一致。
为验证RNA-seq结果，选择了六个DEGs进行RT-qPCR分析。RT-qPCR观察到的表达趋势与转录组数据完全一致，确认了测序结果的可靠性。
讨论
本研究采用RNA-seq表征了大流行和新兴霍乱弧菌谱系在毒力诱导（AKI）与非诱导（LB）条件下的转录反应。与AKI培养基在模拟宿主肠道环境中的作用一致，所有三个菌株均表现出主要定植因子tcpA的强烈上调。此外，典型的毒力基因ctxAB、zot和ace在两个产毒菌株（N16961和VC6050）中被特异性诱导，证实AKI条件有效激活了核心毒力调节子。
值得注意的是，与细菌趋化性和生物膜形成相关的基因在AKI培养基中所有三个菌株中 consistently 下调。这种转录转变表明细胞资源从环境持久性机制向宿主定植程序的全球重新分配——这一策略先前与细胞内环二鸟苷酸（c-di-GMP）水平降低有关。在霍乱弧菌中，磷酸二酯酶VieA降低c-di-GMP，从而抑制vps介导的生物膜形成并促进如TCP等定植因子的表达。我们的数据与此模型一致，强化了低c-di-GMP状态有利于毒力而非环境适应的观点。
有趣的是，产毒新型谱系菌株VC6050比经典大流行菌株N16961表现出更显著的趋化性和生物膜相关基因抑制。我们假设这种 enhanced 下调可能反映了一种进化策略，以最大限度地减少宿主免疫检测或噬菌体捕食。例如，减少鞭毛合成和生物膜产生可能会降低免疫原性并减少对噬菌体识别的易感性。支持这一观点的是，我们之前的工作表明这些新谱系分离株对VP3噬菌体的敏感性降低，表明在感染过程中可能存在有利于 stealth 的共同进化适应。
基于转录组分析，我们确定了VC1123——一个在所有三个菌株中高表达的基因——作为毒力调节的候选因子。VC1123编码一个包含DUF2878（PF11086）结构域的保守蛋白，并在PhrR调节子（RegPrecise）中注释，暗示受MerR家族转录因子PhrR的调节。使用N16961作为亲本菌株，我们构建了框内缺失突变体（N16961-ΔVC1123）和回补衍生物。新生乳鼠的竞争性定植实验显示，VC1123的缺失赋予肠道定植能力增强，且不改变体外有氧或厌氧条件下的生长。此外，侧翼基因（VC1120–VC1125）的转录保持不变，排除了极性效应。这些发现共同表明VC1123作为定植的负调节因子发挥作用。
对ΔVC1123突变体的RNA-seq分析揭示了外膜孔蛋白基因的显著失调：ompU dramatic 上调（315.6倍），而ompT下调（8.47倍），尽管toxR或toxS的表达没有可检测的变化。这一观察结果尤为重要，考虑到OmpU和OmpT在霍乱弧菌发病机制中 well-established 的作用。OmpU增强对胆汁盐和阳离子抗菌肽的抵抗力，促进对肠道上皮细胞的粘附，并促进小鼠模型中的定植。相比之下，OmpT损害胆汁耐受性并降低肠道适应性。值得注意的是，抗OmpU抗体在体外抑制细菌附着并在体内减少定植，且OmpU还能触发肠道上皮细胞分泌IL-8，可能 shaping 宿主炎症反应。此外，OmpU已被认为是上皮细胞内吞作用的受体，并作为霍乱毒素包装到外膜囊泡（OMVs）中的支架，从而稳定毒素在肠道中的活性。
鉴于toxR/toxS的表达未受影响，我们的数据表明VC1123通过不依赖ToxR的途径调节ompU/ompT。潜在的机制包括通过替代转录因子直接或间接调节、转录后控制或宿主或微生物群衍生信号的调节。例如，肠道微生物代谢物已被证明影响ompU表达和定植效率。此外，观察到的relB下调——RelE/RelB毒素-抗毒素系统的一个组成部分——可能 contribute 于该表型，因为TA系统可以影响其他细菌中的生物膜形成和应激适应，尽管其在霍乱弧菌中的作用仍不清楚。我们假设VC1123可能作为PhrR相关调节模块的一部分，将环境或氧化还原感应与 outer membrane 重塑联系起来。VC1123的缺失破坏了这种调节平衡，导致OmpU和OmpT的 reciprocal 调节，从而独立于经典ToxR/ToxS通路增强肠道适应性。
总之，我们的研究结果表明，VC1123作为一个功能未知的高度保守基因，通过可能抑制ompU和/或促进ompT（通过不依赖ToxR的机制）来充当肠道定植的抑制因子。ΔVC1123突变体毒力的增强 underscore 了在宿主感染期间微调外膜组成的重要性。未来的研究应致力于：（i）定义VC1123蛋白的分子功能，（ii）确定其调节靶点和相互作用伙伴，以及（iii）确定VC1123的表达是否受肠道中宿主或微生物线索的调节。这些见解可能揭示霍乱弧菌毒力控制的新层面，并为破坏定植的策略提供信息。
本研究有几个局限性。VC1123的功能分析仅在N16961遗传背景中进行，因此尚不清楚观察到的效应是否在其他第七次大流行或新型谱系霍乱弧菌菌株中保守。此外，尽管VC1123的缺失导致ompU和ompT的 reciprocal 调节并增强肠道定植，但我们尚未直接证明孔蛋白失衡是定植表型的因果驱动因素。未来使用多种菌株背景和靶向遗传上位性分析的研究将 required 以确定VC1123功能的普遍性，并 definitively 将OmpU/OmpT失调与肠道适应性联系起来。
