《Frontiers in Immunology》：Non-HLA antibody trajectories may predict kidney transplant outcomes
引言
人类白细胞抗原（HLA）长期以来一直是移植免疫学的核心，是决定移植物存活和预测抗体介导排斥反应（AMR）的关键因素。供体特异性HLA抗体（DSA）是AMR的明确介质；然而，越来越多的证据表明，针对非HLA抗原的抗体在移植物损伤中也发挥着重要作用，尤其在肾、心和肺移植中。这些抗体的检测可为移植物病理学提供关键见解，改善移植前后的风险分层，促进免疫激活的早期识别，并为个体化免疫抑制策略提供信息。尽管潜力巨大，非HLA抗体目前尚未被纳入常规移植评估或分配方案。虽然它们在DSA阴性排斥反应中的作用日益被认可，但缺乏经过验证的检测方法和具有临床指导意义的生物标志物，仍限制了其更广泛的临床应用。
反映这一不断发展的认识，Banff 2017更新将AMR的定义扩展至包括与HLA和非HLA抗体相关的组织损伤。非HLA抗体包含一组异质性的同种和自身抗体，针对如MICA、血管紧张素II 1型受体（AT1R）、内皮素受体A型（ETAR）、波形蛋白、基底膜蛋白聚糖和内皮细胞成分等抗原。尽管其潜在的临床相关性，非HLA抗体检测在很大程度上仍局限于研究环境，受限于缺乏标准化检测方法以及对其致病阈值和临床意义的不完全了解。此外，虽然内皮细胞常被认为是非HLA反应性的主要靶标，但内皮细胞交叉配型试验在肾移植中显示出与排斥结果的有限相关性。
多重Luminex单抗原微球技术的进步为更广泛、更系统地检测非HLA抗体提供了新的机会。其中，一个包含60种独特非HLA抗原的商业化检测面板已显示出用于全面分析的潜力。然而，其在常规临床实践中的效用及其对移植结果的预测价值仍有待充分确立。
本研究采用这种多重Luminex检测方法，纵向评估了尸体供肾移植受者的非HLA抗体谱。本研究旨在：调查其发展的潜在触发因素，包括妊娠和移植；确定非HLA抗体是预先存在的还是在移植后新出现的；评估它们与使用血管来源内皮细胞的交叉配型反应性的关系；以及评估它们与肾移植结果的关系。
我们假设非HLA抗体的时间动态——或其轨迹——而非仅其存在，承载着传统HLA指标未能捕获的有意义的预后信息。我们的研究结果表明，非HLA同种免疫遵循一条独立的、具有临床指导意义的途径，动态的非HLA抗体谱分析可以增强移植后风险评估并为早期免疫抑制干预提供信息。
材料与方法
研究设计与患者队列
这项回顾性观察性队列研究分析了加州大学旧金山分校（UCSF）尸体供肾移植受者生物样本库中的血清样本。研究遵循《赫尔辛基宣言》进行，并经UCSF机构审查委员会批准。由于其回顾性性质，患者未进行随机分组，而是根据反映真实世界移植条件的具有临床相关性的免疫学特征进行分组。
总共筛选了2013年1月至2018年12月期间接受尸体供肾移植的1152例连续患者。排除了年龄小于18岁或接受涉及肾脏的多器官移植的患者。基于是否存在预存供体特异性HLA抗体，患者被分为两组：pfDSA阴性组和pfDSA阳性组。该分类捕获了已确定的移植前免疫风险。每组进一步按移植物结局进行分层，以评估抗体谱与移植物性能的关系，随后根据是否存在新发供体特异性抗体进行细分，以评估移植后致敏的贡献。该分组策略旨在在成本和生物样本库样本可用性的实际限制内，最大化科学相关性和可解释性，为研究肾移植中的非HLA抗体动力学和免疫动态提供一个基于临床的、假设生成的框架。
在68例移植物失功的患者中，59例同时拥有移植前和移植后血清样本可用于非HLA抗体检测的患者被纳入本研究。从具有功能移植物的受者中，识别出计算面板反应性抗体（cPRA）≥80%的高度致敏个体，并选择了108例患者——在那些有和无dnDSA的患者之间进行平衡——以提高各组间基线免疫风险的可比性。这种选择形成了一个最终队列，包含167例患者，代表八个不同的组。总共纳入334份血清样本——在移植前3个月内和移植后6个月收集——用于非HLA抗体谱分析。人口统计学和临床数据已总结。
为了评估肾移植后非HLA PRA的时间变化，一个包含13名受者的亚组在移植后5-9个月内进行了多个时间点的纵向监测。该亚组的选择完全基于系列移植后血清样本的可用性，与临床结局或抗体状态无关。
免疫抑制方案
该队列中尸体供肾移植的免疫抑制治疗包括使用抗胸腺细胞球蛋白进行诱导。具有预存供体特异性抗体的受者在术后第1天和第2天额外接受一剂静脉注射免疫球蛋白。维持免疫抑制包括他克莫司、霉酚酸酯和泼尼松。
非HLA抗体谱分析
使用包含88种不同Luminex微球偶联非HLA抗原的原型非HLA抗体检测微球组测量非HLA IgG抗体。检测根据制造商方案进行。每次运行均包含内部阳性和阴性对照血清以及两个内置对照微球以确保检测有效性。使用100名未输血男性供者的血清建立了参考范围。排除反应性最强的15个样本，并为每个抗原计算剩余85个的平均MFI。如果测试样本的MFI≥平均值的3倍，则视为阳性。非HLA面板反应性抗体（PRA）百分比计算为：（阳性微球数 ÷ 88）× 100。基于反应性评分将非HLA抗体分为四分位数进行描述性分析。
内皮细胞交叉配型试验
内皮细胞交叉配型（ECXM）检测可识别与人类内皮细胞上抗原结合的受者IgG抗体，包括非HLA靶标。由于内皮细胞构成了移植物和受者之间的主要免疫界面，ECXM能够识别标准基于淋巴细胞的交叉配型试验未能捕获的具有临床相关性的同种和自身抗体反应。
为了评估非HLA抗体与ECXM反应性之间的关联，选择了八名针对这些细胞系无可检测HLA抗体的移植受者的血清，与六种不同培养的人内皮细胞系孵育。孵育后，去除未结合的抗体，并使用荧光标记的抗人IgG二抗检测结合的IgG。抗体结合通过流式细胞术定量，并表达为相对于阴性对照血清的中位通道偏移，使用50 MCS作为阳性ECXM的阈值。
移植物活检以及排斥反应和移植物存活的定义
对于具有预存DSA或cPRA ≥80%的受者，在移植后6个月进行方案活检，如果存在炎症则在12个月重复。在临床怀疑排斥反应时进行病因活检。总的来说，在移植后一年内所有受者均可获得活检数据。排斥反应根据2015年Banff标准定义。AMR包括活动性、慢性和疑似形式。急性细胞排斥反应（ACR）包括Banff 1-3级和慢性活动性T细胞介导的排斥反应。
结果以及供体和受者基线特征来源于器官获取和移植网络（OPTN）数据库、电子健康记录和HLA实验室数据库。截止至2025年12月31日，使用OPTN数据确定死亡删失移植物存活。移植物存活定义为无需透析或再次移植。
统计分析
在使用内部阳性和阴性对照微球的MFI值验证检测有效性后，进行数据分析。使用制造商提供的原始和背景MFI值计算每个微球的背景校正MFI。使用未配对的双尾Student t检验进行两组独立比较。p值<0.05被认为具有统计学意义。对于涉及单个非HLA抗体的分析，统计显著性定义为调整后p值≤0.05。所有分析均使用GraphPad Prism 10进行。主要结局使用Kaplan–Meier生存曲线分析，并应用对数秩检验比较各组间的移植物存活。
结果
研究队列的基线特征
总结了167例肾移植受者按pfDSA、dnDSA和移植物结局分层的人口统计学和临床特征。移植时的中位年龄为47岁，女性受者占主导地位。该队列具有种族和民族多样性，大约三分之一为西班牙裔/拉丁裔，四分之一为非裔美国人，22.2%为白人，18.6%为亚裔。体重指数、供者特征、透析时间和原发疾病病因在各组间具有可比性，大多数受者为高度致敏。总体而言，基线特征在研究组间均衡良好。
肾移植血清中非HLA抗体的流行率
在移植前样本中，大多数样本的非HLA PRA为1-10%，16.2%在11-20%之间，7.2%在21-57%之间。在移植后样本中，80.8%的非HLA PRA为1-10%，9.6%在11-20%之间，5.4%在21-39%之间。未观察到非HLA PRA水平与受者年龄、ABO血型或HLA cPRA水平之间的显著关联。
配对相关性分析确定了几个强相关的抗体簇。抗体抗胶原蛋白I、III、IV、V和VI型（不包括II型）与肌球蛋白高度相关，而FN1与肌球蛋白的相关性甚至更强。血管内皮生长因子A（VEGFA）和EDIL3也与转铁蛋白强相关。
IgA肾病和非裔血统与升高的非HLA PRA相关
与糖尿病肾病作为终末期肾病病因的患者相比，患有IgA肾病的患者的移植前非HLA PRA显著更高。此外，非裔美国人受者的非HLA PRA显著高于白种人受者。
妊娠和既往移植史增强非HLA抗体形成
通过妊娠或移植接触同种抗原与HLA抗体形成增加相关。为了调查类似的致敏是否影响非HLA抗体产生，我们分析了移植前非HLA PRA与性别和移植史的关系。移植前非HLA PRA水平在女性中显著高于男性，这表明妊娠相关的同种抗原暴露可能诱导非HLA抗体产生。同样，再次移植候选者的非HLA PRA显著高于首次移植候选者，表明既往移植暴露也有助于非HLA致敏。
基于四分位数的抗体反应性分析显示，针对CXCL11和VWF-FL的抗体在女性中较男性减少。相比之下，针对LMNA、STAT6、GAPDH和SNRPN的抗体在女性中更为丰富。在再次移植候选者中，大约30%的非HLA抗体表现出四分位数间的变化——既有增加也有减少。值得注意的是，针对FGF2、SPN和NGF的抗体丰度下降，而针对转铁蛋白的抗体显著增加。
非HLA PRA的时间动态可区分肾移植结局
在移植前或移植后血清样本中，移植物失功受者和功能移植物受者之间的非HLA PRA水平没有统计学上的显著差异。然而，在功能移植物组内，移植后非HLA PRA较移植前显著下降，而在移植物失功组中水平保持不变。
为了评估特定抗体变化的动态，我们将所有60种非HLA抗体基于丰度分为四分位数。然后追踪从移植前到移植后的四分位数间变化：在功能移植物受者中，20%的抗体转移到更高的四分位数，27%转移到更低的四分位数，53%保持不变。在移植物失功的受者中，15%转移到更高的四分位数，22%转移到更低的四分位数，64%没有变化。
当评估功能移植物患者移植前到移植后血清中所有非HLA抗体的变化时，以下抗体显著减少：成纤维细胞生长因子受体1（FGFR1）、组氨酰-tRNA合成酶（HARS）、波形蛋白（VIM）、微管蛋白α 1B（TUBA1B）、微管蛋白β I类（TUBB）、纽蛋白（VCL）、分化簇40（CD40）、白细胞介素18受体1（IL18R1）和丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、血管紧张素II 1型受体（AT1R， T）和内皮素受体A型（ETAR， C）在移植后血清中显著减少。
对无移植前DSA和新发DSA受者的亚组分析显示，在移植物失功的受者中，从移植前到移植后，非HLA PRA没有显著变化。相比之下，功能移植物的受者显示出移植后非HLA PRA的显著降低。在组1（功能移植物）中，11%的抗体增加，42%减少，47%保持在相同的四分位数。在组3（移植物失功）中，10%增加，33%减少，57%未变。具体来说，抗-EMCNv2在组3中从Q4转移到Q2，而抗-VEGFA和抗-ATP5B在组1中从Q4转移到Q2。
移植后非HLA PRA动态评估
为了评估肾移植后非HLA PRA的时间变化，对13名受者在移植后5-9个月内进行了多个时间点的纵向监测。分析显示，非HLA PRA水平不稳定，且不遵循统一的轨迹。这些观察结果强调了非HLA抗体轨迹的个体异质性。
非HLA抗体、ECXM反应性和肾移植结局之间无相关性
使用六种不同的内皮细胞系进行了交叉配型。选择了八名针对这些细胞系无可检测HLA抗体的肾移植受者的血清样本，以评估非HLA PRA、ECXM状态和移植物失功之间的关联。ECXM结果与移植物结局或非HLA PRA水平无关。
肾移植结局
移植后第一年内，ACR的总发生率为6%，AMR发生率为16.2%。几乎所有经历排斥反应的患者——具体来说，所有AMR患者和除一例外所有ACR患者——都出现了dnDSA。AMR的最高发生率出现在同时具有pfDSA和dnDSA的受者中。相比之下，在DSA阴性的受者中，无论移植物功能状态如何，均未观察到排斥反应发作。
插图显示了按pfDSA和dnDSA状态分层的八个研究组的死亡删失移植物存活。总体而言，pfDSA或dnDSA的存在并不能一致地预测移植物存活。有趣的是，组1和组3，两者均为pfDSA和dnDSA阴性，却表现出明显不同的结局，这表明其他因素——例如不同的非HLA PRA轨迹——可能促成移植物丢失。同样，组6和组8，两者均为pfDSA和dnDSA阳性，显示出不同的移植物存活模式，并伴有不同的非HLA PRA轨迹。
讨论
对167例使用88种抗原非HLA阵列进行分析的肾移植受者的纵向分析显示，非HLA体液致敏在移植人群中很常见，可能反映了累积的免疫暴露。虽然总体非HLA PRA在移植后显著下降，但这种减少仅在功能移植物受者中观察到。相比之下，移植物失功的患者，包括那些没有预存或新发供体特异性HLA抗体（DSA）的患者，没有显著变化，表明非HLA同种免疫可以独立于HLA系统促成移植物损伤。这些发现强化了非HLA抗体作为移植中一个独特免疫轴的概念。抗原特异性分析进一步证明，在稳定移植物中反应性净下降，提示在成功移植物功能的环境下存在免疫调节或适应。
移植后多种非HLA抗体特异性下降可能反映了与移植物稳定性相关的免疫调节。几个受影响的靶标参与了基本的细胞和免疫过程。FGFR1和MAPK1是生长因子依赖性信号传导的关键介质，而HARS在蛋白质合成中起作用。细胞骨架和粘附相关蛋白——包括VIM、TUBA1B、TUBB和VCL——对于维持细胞完整性和促进组织重塑至关重要，并已牵涉于损伤和修复反应。免疫相关靶标，如CD40和IL-18R1，参与共刺激和促炎信号传导，表明稳定移植物受者的免疫激活减弱。此外，对AT1R和ETAR的反应性降低——这些G蛋白偶联受体参与血管调节，并日益被认为是移植中的非HLA靶标——可能表明该队列中内皮或血管免疫应激减弱。值得注意的是，对某些靶标的高滴度反应在所有结局组中持续存在。总之，这些数据突出了非HLA抗体的动态、移植物依赖性行为，并强调了它们对于超越传统HLA指标的免疫监测和风险分层的相关性。
该队列中的所有患者都接受了相同的预处理和维持治疗；因此，在功能移植物受者中观察到的非HLA抗体水平下降不太可能归因于免疫抑制。尽管缺乏机制数据，但很可能稳定的移植物功能促进了一种耐受性环境，有利于非HLA体液反应的收缩，而移植物失功可能维持了它们的持续存在。
IgA肾病和非裔血统与升高的非HLA PRA相关
非HLA PRA在IgA肾病受者中高于糖尿病患者。IgA肾病以免疫复合物沉积和系统性免疫激活为特征，这可能促进针对自身抗原、内皮或次要组织相容性抗原的非HLA抗体的发展。相比之下，糖尿病肾病源于高血糖引起的代谢和血流动力学应激，缺乏显著的适应性免疫成分，导致非HLA致敏的可能性较低。
非HLA PRA在非裔美国人中高于白种人受者。非裔美国人个体表现出更大的遗传多样性，包括HLA和非HLA多态性，这可能增强同种免疫反应性。较高的基线免疫激活和炎性细胞因子水平进一步有助于增加体液反应性。此外，较高的临床致敏率以及潜在的环境或表观遗传影响可能使该人群更容易形成非HLA抗体。
非HLA PRA和HLA cPRA代表了肾移植中不同的同种免疫途径
值得注意的是，非HLA抗体反应性的程度，以非HLA PRA评分衡量，与传统致敏指标无关；具体而言，移植前非HLA PRA与计算的HLA-PRA（cPRA）不相关。非HLA PRA和cPRA反映了免疫学上不同的过程。虽然cPRA测量针对多态性HLA分子的抗体，但非HLA PRA捕获了对非HLA靶标的反应性，例如内皮细胞抗原（如AT1R、ETAR）和自身抗原。这些抗体通过不同的致敏途径产生——HLA抗体通常源于输血、妊娠或移植，而非HLA抗体可能来自组织损伤、炎症、自身免疫或感染。从机制上讲，HLA抗体形成由适应性免疫反应驱动，而非HLA抗体可能涉及先天免疫、耐受性丧失或非经典抗原呈递。因此，非HLA PRA和cPRA之间缺乏相关性突出了它们各自的独立起源，并支持在移植受者中进行全面的同种免疫风险分析的需要。
妊娠和再次移植塑造非HLA抗体反应的广度和特异性
妊娠和既往移植的同种抗原暴露增强了非HLA抗体产生，导致女性和再次移植受者的移植前非HLA PRA水平升高。妊娠使母体免疫系统暴露于父系HLA和非HLA抗原，而移植引入了多种供者来源的抗原，包括内皮和细胞内靶标。非HLA抗体谱存在性别特异性差异，女性对CXCL11和VWF-FL的反应性降低，但对LMNA、STAT6、GAPDH和SNRPN的抗体水平升高。这些模式表明，妊娠相关的致敏影响了非HLA体液反应的广度和特异性。再次移植与非HLA抗体库的动态变化相关，大约30%的抗原显示出四分位数间的变化。虽然一些抗体可能由于调节机制而下降，但其他抗体，如抗转铁蛋白抗体，显著增加，表明抗原特异性扩增而非普遍免疫激活。
移植后非HLA PRA的时间不稳定性
对13名肾移植受者5-9个月的连续监测揭示了非HLA PRA水平存在显著的时间变异性，其特征是患者特异性波动而非一致趋势。模式包括初始下降随后反弹、持续下降以及移植后早期增加，反映了受既往致敏、移植物相关损伤和免疫抑制效果影响的动态免疫过程。这些观察结果强调了非HLA抗体反应的非线性、个体化性质，受多种抗原靶标和可变免疫调节驱动。这些发现警告不要依赖单一的移植后时间点进行免疫风险评估，并强调了纵向监测的重要性。总的来说，非HLA PRA代表了一个独特且适应性强的免疫轴，对移植监测和结果预测具有重要意义。
抗原特异性见解和网络生物学
我们旨在评估非HLA抗体的滴度，并研究其丰度是否与抗原的特定亚细胞位置或抗原性相关。就抗原的亚细胞定位而言，高丰度抗体表现出不同的亚细胞定位，反映了其多样的生物学功能。关于肾移植患者抗体与抗原位置或抗原性的相关性，Sutherland等人报告称，具有高水平抗蛋白激酶C zeta（PKCζ；基因PRKCZ）抗体的肾移植患者发生了排斥反应，他们很可能最终导致移植物丢失。我们检测到针对细胞质酶（ENO1、GAPDH、GSTT1）、基质蛋白（胶原蛋白I-VI、纤连蛋白）和血管介质（VEGFA）的最高中位滴度。移植后，针对ETAR、FGFR1、MAPK1和纽蛋白的抗体显著下降，与肾素和AT1R的减少相平行。α-烯醇化酶（ENO1）是一种与癌症和自身免疫疾病相关的自身抗原，已在患者血清中检测到抗ENO1抗体。相关性图谱确认了三个强簇：这些网络意味着对结构连续移植物区室的协同靶向，支持内皮激活和表位扩散的机制假设，这些现象在慢性活动性AMR中有详细描述。
与当代文献的整合及临床相关性
我们的研究结果证实并扩展了关于实体器官移植中非HLA免疫的快速增长的证据基础。STAR 2022工作组审查得出结论，超过90%的肾移植候选者拥有可检测的非HLA抗体，然而标准化阈值、可重复的平台和前瞻性验证仍然是主要未满足的需求。在迄今为止最大的单中心队列中，Senev等人证明，每增加10个阳性非HLA特异性，发生AMR组织学的风险增加14%，并且这种关系在缺乏供体特异性HLA抗体的情况下持续存在。我们的基于轨迹的数据通过显示变化的方向和幅度——而非静态负担——最能区分功能结局，从而完善了这些观察结果。
关于抗原特异性致病性的证据仍然好坏参半。在儿科受者中，Comoli等人发现高水平的抗-GSTT1抗体与AMR独立相关，并在整个随访期间持续存在，而一个西班牙成人队列报告抗-GSTT1对移植物滤过或存活没有影响。这种不一致突出了非HLA靶标的异质性，并提示年龄、种族、免疫抑制和检测方法可能产生影响。除了GSTT1，多中心分析已将针对细胞内信号蛋白（STAT6）、细胞质酶（ENO1）和膜受体（AT1R、ETAR）的抗体广度与移植物功能障碍联系起来；然而，因果关系仍有待证明。心脏移植的数据呼应了这些肾脏发现：Butler等人报告非HLA抗体负荷与低水平HLA-DSA协同加速移植血管病变，而See等人观察到非HLA介导的和混合抗体血管病变之间的表型趋同，提示微血管损伤的趋同机制。连同我们观察到非HLA PRA仅在功能移植物中下降，这些研究支持一个范式，即非HLA免疫的动态监测提供了超越基线血清状态的附加预后价值。STAR工作组强调了几个研究重点——跨平台标准化、抗原发现、纵向生物样本库以及与HLA抗体的协同建模——所有这些都与我们下面概述的前瞻性、多中心议程相一致。
在该队列中，排斥事件——包括ACR和AMR——在DSA阴性受者中不存在，无论移植物功能状态如何。这些发现表明，在缺乏HLA导向的体液免疫的情况下，活检可检测到的经典形式排斥反应不太可能发生。相反，非HLA抗体可能通过替代机制促成移植物功能障碍，例如抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）、内皮激活或其他非经典效应途径。
尽管DSA与移植物损伤之间的关联已确立，但我们的数据表明，无论是pfDSA还是dnDSA的存在都不能一致地预测移植物存活。这种异质性强调了同种移植物损伤的多因素性质，其中非HLA抗体和先天免疫激活即使在DSA阴性的情况下也可能调节结局。组1和组3——两者均缺乏pfDSA和dnDSA——表现出显著不同的移植物结局这一观察结果支持了一个日益增长的认识，即补体非依赖性机制、微血管炎症和先天免疫激活可能在某些受者中促成移植物丢失。同样，DSA阳性受者（组6和组8）之间不同的存活轨迹表明，免疫环境——包括非HLA PRA轨迹的演变——可能影响DSA的临床影响。
优势与局限性
本研究的非随机、回顾性设计反映了真实世界移植的异质性，并使得
