M6A介导的Bhlhe22稳定作用通过激活PI3K-AKT-GSK3β信号通路来抑制骨质疏松症中的骨形成过程

《Stem Cell Research & Therapy》：m6A-mediated stabilization of Bhlhe22 suppresses osteogenesis in osteoporosis by activating the PI3K-AKT-GSK3β signaling axis

m6A修饰通过调控Bhlhe22表达影响PI3K-AKT-GSK3β通路，导致骨髓间充质干细胞成骨分化障碍和骨质疏松。该研究构建大鼠骨质疏松模型，通过病毒介导的基因过表达和沉默验证Bhlhe22的作用，结合MeRIP-qPCR和ChIP-seq揭示m6A修饰位点2023在稳定Bhlhe22 mRNA中的关键作用，并发现该通路是骨质疏松治疗的新靶点。

　　

摘要

背景

骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化能力受损会促进骨质疏松症（OP）的发病机制。虽然RNA修饰（如N6-甲基腺苷（m⁶A））可以调节干细胞的分化，但它们在OP中的作用仍不明确。转录组分析显示，在OP-BMSCs中基本螺旋-环-螺旋家族成员e22（Bhlhe22）的表达上调。本研究旨在探讨m⁶A修饰的异常是否通过上调Bhlhe22来影响BMSCs的成骨分化，从而导致OP的发生。

方法

雌性Sprague-Dawley大鼠被切除卵巢（OVX）以建立OP模型。分离BMSCs，通过流式细胞术和三系分化进行鉴定，并对其进行成骨诱导。Bhlhe22的表达通过慢病毒过表达、siRNA介导的敲低以及腺相关病毒（AAV）介导的shRNA敲低在体内进行调节。基因表达通过免疫荧光、定量PCR（qPCR）、Western blotting和RNA测序进行评估。成骨分化通过碱性磷酸酶（ALP）染色、阿利扎林红S（ARS）染色和成骨标志物表达来评价。使用微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学方法评估骨骼结构。通过PI3K-Akt通路激活（recilisib）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、ChIP-qPCR、点印迹、甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）-qPCR、荧光素酶报告基因实验和定向突变等方法研究相关机制。

结果

OP-BMSCs中的m⁶A水平发生异常。OP-BMSC和OVX大鼠股骨中的Bhlhe22 mRNA和蛋白质水平显著升高。Bhlhe22的敲低恢复了OP-BMSCs的成骨潜能，并增加了OVX大鼠的骨体积/小梁厚度，而Bhlhe22的过表达则抑制了成骨作用。Bhlhe22通过直接激活磷脂酰肌醇-3-激酶调节亚基3（Pik3r3），从而激活PI3K-AKT-GSK3β通路来抑制成骨作用。重要的是，m⁶A在2023位的修饰稳定了Bhlhe22 mRNA，使其表达增加。对该m⁶A位点的突变减弱了Bhlhe22的抑制作用。

结论

m⁶A修饰稳定了Bhlhe22 mRNA，导致其在OP中的过度表达。升高的BHLHE22蛋白通过转录激活Pik3r3和PI3K-AKT-GSK3β信号通路来抑制BMSC的成骨作用。针对m⁶A-Bhlhe22-PI3K通路可能是治疗骨质疏松症的有前景的策略。

图形摘要