《Frontiers in Cellular Neuroscience》：Prominent astrocytic GLAST pathology occurs in newborn human and piglet hypoxic–ischemic encephalopathy: modeling relationships among laminar neuropathology, seizures, and therapeutic hypothermia
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本文综述探讨了星形胶质细胞谷氨酸-天冬氨酸转运体(GLAST)在新生儿缺氧缺血性脑脑病(HIE)及其小猪模型中的关键作用。研究发现，HIE患儿及模型动物皮层中存在GLAST的异常定位（如胞周聚集），这与癫痫发作负荷及神经元损伤相关。治疗性低温(HT)能恢复GLAST的分布，延迟癫痫发作，并减轻神经元损伤。研究揭示了星形胶质细胞谷氨酸转运异常是新生儿HIE皮层高兴奋性和癫痫发作的潜在机制，为理解HT的神经保护机制提供了新视角。
引言：新生儿缺氧缺血性脑病与癫痫的未解难题
新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是导致新生儿死亡和长期神经功能障碍的主要原因。治疗性低温(HT)已成为中重度新生儿HIE的标准疗法，能改善生存率和部分神经发育结局。然而，癫痫发作仍然是HIE的突出特征，甚至在HT治疗期间或复温后仍可能发生，且常常是亚临床性的，需要连续脑电图(cEEG)监测才能发现。癫痫负荷与损伤严重程度及不良神经发育结局密切相关，但其究竟是加剧损伤还是仅为附带现象，仍存在争议。常用抗惊厥药物疗效有限，且可能具有神经毒性。因此，需要更好地理解新生儿脑损伤后癫痫发作的演变过程、其神经生物学机制，以及它们与HT治疗和神经病理学的关系。由于在患者中直接研究这些机制存在困难，需要能够模拟足月人类HIE关键特征的动物模型。新生小猪具有与足月人类婴儿更相似的脑解剖结构、生理功能和发育时间线，并且允许进行长时间的多通道cEEG采集和同步神经病理学评估，为研究癫痫机制和治疗干预提供了理想的转化平台。本研究旨在：(1) 检验人类新生儿HIE中是否存在GLAST异常；(2) 确定我们的猪模型是否重现了相似的病理变化；(3) 探究GLAST病理、癫痫发作演变和HT之间的关系。我们假设HT能够减轻星形胶质细胞GLAST的破坏，而这种破坏与皮层兴奋性稳定和神经元损伤减轻相关。GLAST是发育早期主要的星形胶质细胞谷氨酸转运体，负责维持细胞外谷氨酸稳态，其失调可能导致兴奋性毒性和网络过度兴奋，从而在新生儿HIE中诱发癫痫。
方法：临床样本与动物模型的整合研究
研究使用了来自多个机构的足月新生儿HIE尸检脑组织样本以及年龄匹配的非HIE对照样本。所有尸检均经过伦理批准。HIE病例包括部分或完全接受HT治疗以及未接受HT治疗的病例。实验动物为2-3日龄的约克夏小猪，被随机分为假手术-常温(SH-NT)、假手术-低温(SH-HT)、缺氧缺血1-常温(HI-NT)和缺氧缺血-低温(HI-HT)组。所有动物均接受连续4通道硬膜外EEG记录。HI损伤通过低氧、窒息性心脏骤停和复苏诱导。HT治疗在复苏后2小时启动，通过冰袋和循环水毯将直肠温度降至34°C，持续20小时后以0.5°C/小时的速度复温。动物存活2-7天后进行脑组织灌注固定。神经病理学分析包括H&E染色以识别缺血神经元，以及针对GLAST、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和突触素(synaptophysin)的免疫荧光染色。使用定制的癫痫分类流程对EEG数据进行量化分析，提取发作事件频率、持续时间、尖慢波事件以及功率谱密度(PSD)等指标。统计分析采用Prism 9.0软件。
结果部分
新生儿HIE患者新皮层GLAST定位异常
与对照病例相比，人类新生儿HIE患者皮层中GLAST的定位显著异常。在皮层I-III层，HIE病例显示出GLAST斑点的持续增大。在I-1层（最表层），HIE-HT婴儿的平均斑点大小接近翻倍（对照~0.2 μm2；HI ~0.4 μm2），这一增加具有统计学显著性（p=0.0213）。在III层也观察到了类似的显著性增大（p=0.0213）。GLAST覆盖神经元胞体（胞周）的面积百分比在表层I-1显著升高，从对照组的<1%增加到HI-NT组的~1%（p=0.0019）和HI-HT组的>3%（p=0.0277）。相反，GLAST斑点的密度显示出反向模式。在更深层的I-2和I-3亚层，斑点密度相对于对照组减少了约50%（分别为p=0.0277和p=0.0198）。逐层分析显示，从I层到III层，GLAST斑点密度总体下降。这些改变共同指向谷氨酸清除微域的结构性破坏。
小猪HI模型重现并纠正了星形胶质细胞GLAST定位异常
研究旨在确定在人类HIE中观察到的GLAST异常是否在小猪模型中重现。在SH-NT小猪中，GLAST呈现精细、均匀分布的斑点。在HI-NT小猪中，GLAST的组织结构被严重破坏，表现为突起碎片化、胞周覆盖减少以及精细神经纤维网斑点丢失，与人类HIE皮层的GLAST紊乱相似。定量分析证实，与SH-NT动物相比，HI-NT小猪II/III层的GLAST斑点大小显著增加（II层p=0.0023；III层p=0.0298），且II层的覆盖面积百分比也显著增加（p=0.0166）。相反，HI-HT小猪的GLAST定位相对正常，显示胞周和细胞外分布得以保留。HT有效地保护了这些变化：HI-HT组II/III层的GLAST斑点大小恢复至与SH-NT相当的水平（II层p=0.0160；III层p=0.0118）。GLAST与GFAP的共染色进一步支持了这些发现，显示在相同皮层区域存在增大的星形胶质细胞突起，而HT有效地减轻了这些变化（II层p=0.0301；III层p=0.0256，HI-NT vs HI-HT）。此外，HT选择性地增加了III层中GLAST的覆盖面积（p=0.0360）。这些结果表明，小猪模型成功再现了人类HIE的GLAST病理，并且HT能够恢复GLAST的完整性。
HI小猪出现显著的cEEG可识别癫痫发作和层状选择性皮层神经病理学
鉴于HT保留了HI-HT小猪的GLAST定位，研究接下来通过分析癫痫活动来检验这种保留是否转化为功能性神经保护。cEEG记录显示，不同实验组的癫痫活动模式存在差异。有趣的是，一些SH-HT小猪在低温阶段（0-24小时，峰值约在8小时）表现出短暂的发作样放电，表明即使没有HI损伤，单独的低温和/或麻醉也可能在某些小猪中诱发癫痫活动。在HI-NT小猪中，损伤后最初24小时内未观察到癫痫活动，但癫痫在约28小时出现，并在36小时左右达到高峰。这些发作通常是严重的，并且常常是致命的。相比之下，HI-HT小猪的EEG记录显示，直到损伤后约52小时才出现癫痫活动，即发作起始被显著延迟，并且发作频率保持在较低水平。混合效应分析表明，在32-44小时的时间段内，HI-NT组的发作事件频率和持续时间均显著高于HI-HT组（频率p=0.01005，持续时间p=0.03973）。功率谱密度(PSD)分析进一步揭示了网络兴奋性的差异。HI-NT小猪的theta波（4–8 Hz）、beta波（12–30 Hz）和快gamma波（70–120 Hz）活动均显著升高，表明HI后网络过度兴奋。尽管SH-HT小猪的这些波段PSD也有所升高，但变化不显著。相反，HI-HT小猪在所有频率波段上的PSD均显著低于基线水平，表明HT深刻抑制了神经网络活动。H&E染色用于量化躯体感觉皮层的神经元损伤。HI小猪表现出特征性的缺血性神经元变性，包括锥体神经元坏死、核固缩和神经纤维网空泡化。定量分析显示，III层的缺血坏死神经元数量显著增加，而I层和II层有增加趋势。HT显著减轻了神经元坏死，尤其是在III层，显示出选择性层状神经保护作用。
皮层深度依赖的GLAST表达模式与癫痫活动的相关性在HT下显现
为了确定星形胶质细胞GLAST的保留是否与癫痫活动减少存在功能联系，我们进行了神经病理学标志物与电生理指标之间的相关性分析。在HI-NT小猪中，所有皮层层的缺血神经元密度与癫痫发作频率均呈正相关，其中III层的关联性最强（R2= 0.7799）。相比之下，HI-HT小猪显示出皮质深度依赖的重组关联：I层呈弱负相关（R2= 0.5191），II层无相关性，III层呈强正相关（R2= 0.9561）。接下来，我们研究了GLAST结构指标与癫痫参数之间的关系。在SH-NT小猪中，癫痫发作频率与II层的GLAST斑点大小呈负相关（R2= 0.9868），癫痫持续时间与III层的GLAST斑点大小呈负相关（R2= 0.7677），表明在生理条件下，特定层的GLAST斑点大小与自发性皮层兴奋性的特定特征相关。SH-HT动物中未观察到显著相关性。在HI-NT小猪中，癫痫负荷与GLAST指标之间的相关性较弱且不一致；相比之下，HI-HT小猪的GLAST密度与癫痫发作频率和持续时间均表现出强烈的正相关性。热图分析显示，这种相关性的强度随着皮层深度的增加而增强，在III层达到顶峰。此外，我们还分析了GLAST结构指标与缺血神经元密度的关系。在HI-NT小猪中，只有皮层II层的缺血密度与GLAST结构指标显示出值得注意的相关性。而在HI-HT小猪中，II层和III层均显示出与特定GLAST结构指标的显著相关。这些分析进一步支持了GLAST功能在神经病理学和癫痫指标中具有皮层层特异性相关性的观点。
HI诱导复杂的癫痫模式
在视觉检查单个EEG迹线时，我们发现每只小猪中可能存在多种不同类型的癫痫发作共存。我们至少识别出两种不同类型的癫痫。例如，大约在初始HI损伤后2天，左右后部躯体感觉皮层检测到低幅度的发作样爆发，提示早期双侧网络活动协调，可能是全身性发作的开始。随后，爆发振幅逐渐增加，最终形成高幅度爆发，并主要出现在左后部皮层，同时在其他皮层区域观察到短暂的“尖峰泄漏”，表明部分传播或亚阈值同步。随后，在正常的EEG活动期间后，突然的尖峰活动重新出现在左后部躯体感觉皮层，并再次伴有相邻区域的同步“泄漏尖峰”。大约在第二天开始约49000秒时，在左后部躯体感觉皮层检测到局灶性癫痫活动。随着癫痫发作的演变，这些局灶性放电进展为跨多个通道的同步高幅度尖峰，最终在HI后约第三天（约127000秒）形成继发性全身性癫痫活动。这些观察表明HI后的癫痫发作类型复杂多样，并存在从局灶性到全身性发作的演变过程。
局灶性和全身性癫痫表现出不同的PSD特征
鉴于观察到的癫痫模式多样性，我们开发了一个自动分类程序来区分癫痫类型。该程序基于尖慢波形形态学和定量信号参数（包括PSD比率、熵、相干性和赫斯特指数）进行检测。事件分类采用多数投票算法，最终得到三个不同的类别：基线、局灶性癫痫和全身性癫痫。局灶性尖慢事件定义为活动局限于单个EEG通道，而全身性尖慢事件则同时在多个通道检测到。各实验组之间局灶性癫痫事件的数量没有显著差异，但观察到较高的个体间变异性。这些局灶性事件平均持续约5秒。相比之下，HI-HT小猪的全身性癫痫事件数量显著更多（p=0.0279）。然而，必须结合治疗背景来理解这一发现：虽然更频繁，但HT组的这些全身性事件持续时间显著更短（约3秒 vs. 约5秒），并且在所有频段的谱功率均显著低于NT动物中观察到的高幅度发作负荷。因此，HT并没有加重癫痫负荷，而是将癫痫格局从长时间的、高强度的局灶性发作事件转变为短暂的、频谱上受到抑制的放电，这些放电仅仅因为它们在多个通道上的同步检测而被归类为全身性。PSD分析显示，局灶性尖慢事件与delta和theta频段（1–8 Hz）的功率增加相关，而全身性事件则以beta波（12–30 Hz）和慢gamma波（30–60 Hz）活动升高为特征。值得注意的是，如前所述，HI-HT小猪在所有频段的PSD值均显著降低，表明HT可能导致神经活动的全面抑制。
HT不能保护HI小猪免受皮层突触小泡耗竭的影响
通过免疫染色检测突触素来间接评估HI损伤和HT治疗后的突触完整性。定量分析显示，在HI-NT和HI-HT小猪的躯体感觉皮层I、II和III层，突触素阳性斑点的密度均显著增加。然而，定性分析显示，与假手术小猪相比，HT治疗的小猪胞周突触前末梢存在高度选择性丢失。在II层和III层观察到突触素阳性斑点大小的显著减小，I层仅有减小趋势。这种突触小泡改变在HI-NT和HI-HT小猪中均被观察到，其中II层的大小变化最为显著，这支持了胞周突触前末梢的选择性丢失。这表明，虽然HT在GLAST保护和减轻癫痫方面有效，但它未能阻止HI损伤导致的突触结构改变，突触完整性受损可能是HT无法完全逆转的损伤方面。
讨论与总结
本研究以人类临床HIE尸检脑组织为指导平台，探讨了使用具有cEEG监测的小猪模型来研究HI脑损伤和癫痫发生机制。我们发现GLAST改变是临床和实验性HIE中共同的异常，验证了我们的小猪模型。通过对接受或未接受HT治疗的HI小猪的EEG变化进行广泛探究，我们确定了GLAST病理、神经退行性变和癫痫发作之间的重要关系。人类新生儿HIE显示出层状特异性的GLAST重塑，表现为斑点增大和密度降低，这可能意味着谷氨酸清除微域的破坏。新生小猪模型成功重现了人类类似的层状易损性和癫痫活动。HT通过将GLAST斑点大小和星形胶质细胞反应性恢复至正常水平，保留了GLAST的组织结构，尤其是在易损的II/III层。在功能上，HT延迟了癫痫发生，显著降低了癫痫发作的负荷、持续时间和频谱功率。相关性分析揭示了皮层深度依赖的关联，特别是在HT治疗后，III层的GLAST密度与癫痫指标呈现强正相关，提示HT可能促进了该层GLAST功能的适应性重组以稳定网络。此外，研究观察到HI后存在复杂的癫痫模式，包括从局灶性到继发性全身性发作的演变，并且通过自动分类和PSD分析可以区分这两种类型。然而，HT未能保护HI引起的皮层突触小泡耗竭，突触完整性受损仍是其神经保护的局限性之一。综上所述，本研究将星形胶质细胞GLAST病理确定为新生儿HIE癫痫发作的一个突出且可调控的特征。HT通过恢复GLAST微域的结构和功能，稳定皮层兴奋性，从而延迟癫痫发作并减轻损伤。这些发现不仅加深了对HIE病理生理学的理解，也为开发针对星形胶质细胞谷氨酸转运系统的新型神经保护策略提供了重要依据。未来研究需要进一步阐明GLAST功能改变与癫痫网络动态之间的因果关系，并探索联合疗法以更全面地保护神经元和突触功能。
