双探针基因组挖掘揭示新型瓜氨酸修饰的套索肽Citrulassin N及其在RiPPs定向发现中的方法学价值

《Frontiers in Microbiology》：Dual-probe genome mining identifies citrulassin N, a novel citrulline modified lasso peptide from Streptomyces sp. NAX00255

这项研究通过创新的“双探针”基因组挖掘策略，成功从放线菌Streptomyces sp. NAX00255中发现并鉴定了新型瓜氨酸修饰的套索肽citrulassin N。该策略巧妙结合了对套索肽环化酶(CitC)和瓜氨酸化关键酶——肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PAD)的同源搜索，有效提高了对携带稀有翻译后修饰的核糖体合成与翻译后修饰肽(RiPPs)的靶向发现效率。研究不仅扩展了瓜氨酸化套索肽的结构多样性，也为利用生物合成逻辑驱动的新型基因组挖掘方法探索天然产物的化学多样性提供了范例。

　　

1 引言

套索肽是一类具有独特拓扑结构的核糖体合成与翻译后修饰肽（RiPPs）。其结构特征是形成一个N端大内酰胺环，将C端尾部“套”在其中，形成一种类似于轮烷的机械互锁拓扑。这种独特构象赋予了套索肽出色的热稳定性和抗蛋白酶降解能力。凭借如此坚固的结构骨架以及其多样的生物活性（包括抗菌、抗病毒和受体拮抗特性），套索肽已成为天然产物发现和生物工程研究的有力候选者。值得注意的是，套索肽的生物合成机器非常精简，然而，由于其核心肽区域的序列高度可变性，它们涵盖了广阔的化学空间。

在通过基因组挖掘发现的套索肽家族中，citrulassins构成了一个特别有趣的亚群。这类肽的标志性特征是一个由精氨酸经肽酰基精氨酸脱亚胺酶（PAD）催化脱亚胺化产生的、罕见的瓜氨酸残基。瓜氨酸化在细菌天然产物中极为罕见，在citrulassin A被发现之前，在RiPPs中也前所未有。引人注目的是，负责此修饰的PAD并不编码在经典的套索肽生物合成基因簇（BGC）内，而是位于基因组的其他位置，揭示了一种功能必需的修饰酶在遗传上与核心途径相分离的不寻常生物合成逻辑。这种非典型的基因组排列提出了关于途径组织、酶募集和RiPP生物合成系统隐藏化学潜力的基本问题。

传统的活性导向筛选方法长期受到化合物重复发现率高的问题困扰。相比之下，基因组挖掘已成为后基因组时代的一种有力策略，能够系统地识别生物合成基因簇并靶向发现新型天然产物。然而，识别携带稀有和非经典修饰（尤其是那些由编码在核心BGC之外的酶催化的修饰）的RiPPs，使用单探针或基于基序的基因组挖掘策略仍然具有挑战性。

2 材料与方法

本研究采用了一种双探针基因组挖掘策略，旨在选择性识别携带瓜氨酸修饰的citrulassin型套索肽。首先，以citrulassin A生物合成途径中的套索肽环化酶基因（citC）作为初始探针，筛选IFB细菌基因组数据库，识别出多个候选套索肽BGCs。随后，使用RiPPMiner平台对相应的核心肽进行注释和分类。为了进一步富集瓜氨酸修饰的候选物，使用一个已确认的PAD酶（WP_064069847.1）作为第二个探针进行同源性搜索，从而优先筛选出同时拥有套索肽合成机制和推定PAD同源物的菌株。在此策略指导下，通过发酵和靶向分离，发现了一种先前未被表征的瓜氨酸修饰套索肽——citrulassin N。

3 结果

3.1 基因组挖掘揭示候选Citrulassin型套索肽生产者

采用两步靶向基因组挖掘策略从IFB细菌基因组数据库中识别潜在的citrulassin生产菌株。第一轮，以citrulassin A生物合成基因簇（BGC）中的套索肽环化酶基因citC作为BLASTP查询序列，设定>45%的序列同一性阈值。此搜索得到了分布在34个不同细菌菌株中的34个推定套索肽BGCs。为了评估这些BGC是否编码citrulassin型前体肽，使用RiPPMiner平台分析了相应的前体肽。值得注意的是，所有预测的核心肽在第9位共享一个保守的精氨酸残基，该位置对应套索拓扑结构中紧邻大内酰胺环外的第一个氨基酸。这种位置保守性是citrulassin型套索肽的定义性特征，因为该精氨酸残基是翻译后瓜氨酸化的底物。在第二轮筛选中，使用一个已确认的肽酰基精氨酸脱亚胺酶（PAD）同源物（WP_064069847.1）作为次要探针，对34个第一轮阳性菌株进行BLASTP分析。该分析鉴定出15个菌株同时拥有一个citrulassin样套索肽BGC和一个簇外PAD同源物。保守的含Arg9前体与推定PAD酶的共存，强烈暗示了产生瓜氨酸修饰套索肽的生物合成潜力，从而显著缩小了候选生产者的范围。

3.2 Citrulassin N (1) 的发酵、检测与分离

通过双探针基因组挖掘识别出的15个候选菌株进行了发酵，随后使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）进行代谢物分析。在这些菌株中，Streptomycessp. NAX00255在m/z820.9511处显示出一个显著的分子离子峰，对应[M+2H]²⁺，这与基于RiPPMiner分析预测的瓜氨酸修饰套索肽分子量高度匹配。受此结果鼓舞，对Streptomycessp. NAX00255进行了大规模发酵以利于化合物分离。随后结合ODS中压液相色谱（MPLC）和半制备反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，得到了10 mg目标化合物，命名为citrulassin N。

3.3 Citrulassin N (1) 的结构解析

Citrulassin N被分离为白色无定形粉末。高分辨电喷雾电离质谱（HR-ESI-MS）根据观察到的[M+2H]²⁺离子在m/z820.9511，确定其分子式为C₇₀H₁₂₁N₂₁O₂₄。综合一维（¹H, ¹³C）和二维（¹H-¹H COSY, HSQC, HMBC）核磁共振谱分析，揭示化合物包含15个氨基酸残基。考虑到20个羰基信号占据了21个不饱和度中的20个，我们推断该肽中存在一个额外的环状结构，这与预测的套索肽环状结构一致。LC-MS/MS碎裂数据明确建立了C端七肽（Cit9-Leu10-Ile11-Leu12-Ser13-Lys14-Asn15）的序列，并证实了由八残基片段（Leu1-Leu2-Gln3-Ser4-Ser5-Gly6-Asn7-Asp8）形成的大内酰胺环的存在。这些结果确凿地证明了化合物的平面结构是由一个八元大内酰胺环连接一个七残基C端尾部构成，从而将其结构定义为套索肽。

3.4 Citrulassin N (1) 的推测生物合成途径

基于对Streptomycessp. NAX00255的基因组分析以及citrulassins的保守生物合成逻辑，提出了citrulassin N的合理生物合成途径。套索肽BGC内编码的前体肽由一个前导肽和一个15残基的核心肽组成。生物合成始于前导肽被前导肽酶蛋白水解切割，释放出成熟的核心肽。随后，套索肽环化酶催化Leu1的α-氨基与Asp8的侧链羧酸盐之间形成酰胺键，从而形成八元N端大内酰胺环，这是构建套索拓扑的关键步骤。值得注意的是，前体核心肽中的第九个残基是精氨酸，它位于大内酰胺环外，是瓜氨酸化的底物。Arg9脱亚胺化为瓜氨酸被认为是由一个簇外PAD同源物催化，从而产生了定义citrulassin N的标志性瓜氨酸修饰。最后，C端尾部穿过大内酰胺环，形成机械互锁的套索结构。该生物合成途径与citrulassin A的途径高度相似，强调了保守的citrulassin型套索肽BGC与簇外PAD基因的组合足以指导瓜氨酸修饰套索肽的生物合成。

3.5 Citrulassin N (1) 的抗菌和细胞毒性活性测定

鉴于已报道的多种套索肽均表现出抗菌活性，评估了citrulassin N对一组革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌潜力。结果表明，该化合物仅对金黄色葡萄球菌ATCC 6538表现出微弱的抑制活性，最低抑菌浓度（MIC）为40 μg/ml，而对其他测试菌株未显示出显著活性。

4 讨论

本研究通过整合两个互补的遗传标记的靶向基因组挖掘策略，鉴定并结构表征了一种新的瓜氨酸修饰套索肽citrulassin N。通过结合一个保守的核心生物合成酶（套索肽环化酶，CitC）和一个功能诊断性的修饰酶（肽酰基精氨酸脱亚胺酶，PAD），我们能够有效地优先筛选出真正具有生产citrulassin型肽潜力的候选菌株。这种双探针策略显著减少了需要实验验证的候选生物合成基因簇数量，并最终促成了这种先前未报道的瓜氨酸修饰套索肽的发现。

Citrulassins的一个定义性特征是通过PAD催化的精氨酸脱亚胺化产生一个瓜氨酸残基，这是一种在细菌天然产物中极为罕见的翻译后修饰。值得注意的是，负责此转化的PAD编码在经典的套索肽生物合成基因簇之外。Citrulassin N的成功鉴定强化了以下观点：遗传上不相关的修饰酶可以在RiPP生物合成中发挥重要作用，并且它们在基因组中的存在可以作为特定化学修饰的可靠指标。我们的结果进一步表明，位于大内酰胺环外的保守Arg残基代表了瓜氨酸化的特权位点，强调了套索肽拓扑结构与翻译后修饰之间的紧密相互作用。

基因组分析预测的结构与通过核磁共振和质谱实验确定的结构高度一致，凸显了RiPPMiner等生物信息学工具在指导RiPP发现方面日益增长的可靠性。尽管citrulassin N仅显示出微弱的抗菌活性，但其发现仍然意义重大。这项工作主要不是扩展生物活性空间，而是通过阐明如何定制基因组挖掘策略以选择性发现携带稀有且化学特性鲜明的修饰的RiPPs，从而提升了方法学能力。

更广泛地说，本文展示的双探针基因组挖掘概念很容易扩展到其他RiPP家族。将核心生物合成基因与特征性修饰酶（特别是那些负责不常见或机制有趣的修饰的酶）配对，提供了一种可推广的策略，用于获取可能被传统单探针或基于基序的搜索所忽略的隐藏化学多样性。随着基因组数据库的不断扩展，这种聚焦且由逻辑驱动的挖掘方法对于高效发现结构和生物合成上不寻常的天然产物将变得越来越有价值。

5 结论

总之，我们报道了通过整合套索肽环化酶和簇外肽酰基精氨酸脱亚胺酶的双探针基因组挖掘策略，发现了新的瓜氨酸修饰套索肽citrulassin N。全面的结构解析证实了套索拓扑结构以及基因组分析预测的位点特异性瓜氨酸修饰。这项工作扩展了citrulassin家族，并证明基于生物合成逻辑的靶向遗传筛选可以显著简化对携带稀有翻译后修饰的RiPPs的发现过程。