《Frontiers in Immunology》：Glomerular cell atlas of multi-disease model revealed the characteristic changes of glomerular cell subtypes in diseases
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本文通过整合四种肾小球疾病小鼠模型的单细胞转录组数据，系统描绘了肾小球细胞（包括足细胞、系膜细胞和内皮细胞）在疾病状态下的转录图谱。研究发现，不同疾病模型中既存在共有的损伤相关细胞亚群（如表达TAGLN、CXCL1的共享损伤足细胞），也发现了疾病特异性的亚群（如糖尿病肾病中表达ALDH1A2、THBS1的特异性系膜细胞亚群）。研究进一步通过细胞通讯分析揭示了损伤细胞（如系膜细胞与足细胞）通过特定配体-受体对（如CXCL1/CXCR2、MIF/CD74）招募免疫细胞的潜在机制，为理解肾小球疾病的发病机理和开发靶向治疗策略提供了新的见解和数据基础。
3.1 小鼠肾小球细胞图谱的构建及肾脏疾病致病基因表达特征分析
研究整合了来自不同年龄、疾病背景和病程的小鼠肾小球单细胞转录组测序数据（GSE146912），经过严格的质量控制和批次效应校正，通过无监督聚类获得了29个细胞亚群。利用经典肾脏细胞标志物，鉴定并表征了主要由肾小球细胞组成的细胞亚群，包括足细胞 (PODs)、系膜细胞 (MCs)、内皮细胞 (gECs) 和壁层上皮细胞 (PECs)。本数据集捕获了相当数量的肾小球相关细胞亚群，为后续分析提供了可能。
研究人员系统分析了主要肾脏疾病（如局灶节段性肾小球硬化-FSGS、糖尿病肾病-DN、狼疮肾炎-LN、IgA肾病-IgAN）的全基因组关联研究（GWAS）鉴定的易感基因在不同肾细胞亚型中的表达谱。结果显示，FSGS相关基因主要在肾小球细胞内高表达，尤其是在PODs、PECs和MCs中，但对gECs、肾小球外内皮细胞或各种免疫细胞影响甚微。DN相关基因在不同肾细胞亚型中广泛表达。LN的致病基因在PODs中表达不显著，但主要富集于MCs和巨噬细胞相关亚群。相比之下，IgAN相关基因在gECs、肾小球外内皮细胞和免疫细胞中广泛活跃，但在其他固有肾小球细胞中表达有限。
值得注意的是，研究在17号簇（pro_EC）中发现了多种疾病相关分子的高表达。该亚群表达gEC标志物（如Sost、Ehd3）以及特征性的增殖相关分子（如Top2a、Stmn1），提示肾小球内存在一个独特的增殖性gEC群体，可能在疾病发病机制中起关键作用。
3.2 不同疾病背景下足细胞损伤的独特分子特征
鉴于足细胞 (POD) 和壁层上皮细胞 (PEC) 损伤在蛋白尿发病机制中的关键作用，研究人员对这些群体进行了整合重聚类分析，鉴定出13个不同的亚群。基于特征性基因表达谱，鉴定出两个PEC亚群（PEC_1和PEC_2）。值得注意的是，PEC_1包含来自健康和患病小鼠的细胞，而PEC_2群体主要由疾病组贡献。
不同的损伤足细胞亚群在不同的疾病模型中浮现。这些簇表现出独特的分子特征、疾病来源、转录因子活性和功能富集。POD_Injury_1存在于多种疾病模型中，高表达Tagln、Cxcl1、Crct1、Angptl7、Tgfb2和Flna，提示这是一种在不同肾病中共享的常见损伤反应特征。相比之下，簇2高表达Endou、Cd200、Lgmn、Il18、Dmpk和Spon2，且几乎完全来源于ob/ob小鼠，因此将其注释为POD_ob。同样，簇11主要来源于阿霉素（ADR）处理的小鼠，基于Selenbp1、Lpar1、S100a8、S100a9和Sult1a1的高表达，被命名为POD_ADR。转录因子分析显示，POD_ob特异性表达Churc1、Sp2、Dbp、Foxc2、Mafb和E2f1，而POD_Injury_1和POD_Injury_2均上调Bcl3、Rela、Fosl1和Nfkb2。POD_ADR则以高表达Cebpd为特征。基因本体（GO）分析表明，POD_Injury_1和POD_ob均富集于与细胞骨架和肌动蛋白丝组织相关的条目。而POD_ADR主要参与细胞内信号传导、蛋白质转运和分泌、平滑肌细胞迁移以及凋亡信号通路。
3.3 跨疾病背景的足细胞损伤共享分子特征
为了识别共同的损伤机制，研究人员比较了疾病组和对照组之间足细胞亚群的转录谱，量化了差异表达基因（DEGs）。在不同年龄组和5天肾炎时间点，POD_AP1中鉴定出大量DEGs。此外，POD_1、POD_2和POD_3在衰老、糖尿病和肾炎条件下也表现出大量DEGs。值得注意的是，作为足细胞群主要组成部分的POD_1，随着年龄增长显著下调AP-1相关分子（如Fos、Junb、Jun、Fosb、Atf3）。在肾炎状态下，Spp1和Cebpb显著上调。足细胞亚群的伪时序分析将其分布在五个不同的状态，大多数损伤相关亚群聚集在状态5。GO分析显示，状态5主要与细胞-基质相互作用、肌动蛋白丝组装和组织、伤口愈合、心脏和肌肉组织形态发生、T细胞活化正调控以及白细胞-细胞黏附正调控相关。关键损伤相关基因，包括Tagln、Cald1、Tagln2、Gpx3、Press23和Lgals1，也主要在该状态中高表达。这些特征表明，状态5很可能代表了一种特征性的损伤或修复状态，涉及足细胞损伤后的反应、重塑和免疫调节过程。值得注意的是，肾组织免疫荧光染色证实了Wt1和S100a8在ADR小鼠中的共表达，表明在该疾病模型中部分足细胞高表达S100a8。
3.4 关注糖尿病肾病的系膜细胞损伤分子特征
系膜细胞 (MCs) 对于维持肾小球结构完整性、调节滤过率、合成或降解细胞外基质 (ECM) 以及产生各种细胞因子和生物活性分子至关重要。研究人员对MCs进行了重聚类分析，鉴定出13个不同的亚簇，并根据其特征性基因表达谱进行了注释。其中，重点关注了主要来源于多个疾病组的簇1，注释为Mes_Injury。该亚群高表达Cxcl1、Egr1、Hspa1b、Socs3和Dnaib1。值得注意的是，研究鉴定出几个疾病特异性的MC亚簇——簇3、11和12，它们在ob/ob小鼠中显著扩增。具体来说，Mes_ob_1（簇3）表现出与其他MCs不同的转录组，并在UMAP可视化中表现为离群点。其特征是高表达Aldh1a2、Thbs1、Fbln5、Cdh11和Loxl2。转录因子分析显示，Mes_Injury高表达Fos、Junb、Xbp1和Cebpb，而所有来源于ob/ob小鼠的MCs共享Dbp和Prrx2的高表达。Mes_ob_1独特地表达Mbd2、Spi1和Pura。功能上，GO富集分析表明，Mes_Injury主要与细胞内信号调节和应激反应相关，而Mes_ob_1则更富集于与细胞迁移、组织修复和细胞-基质相互作用相关的过程。所有MC亚簇的伪时序轨迹分析显示，来源于ob/ob小鼠的MCs集中在状态3，其中富集的基因在功能上与抗原呈递、免疫反应、上皮细胞增殖调控以及细胞投射组织负调控相关。
3.5 多种疾病模型诱导产生的共享肾小球内皮细胞损伤亚群
肾小球内皮细胞 (gECs) 对于维持滤过屏障完整性、调节分子交换、平衡凝血与抗凝以及提供结构支持至关重要。其损伤会导致通透性增加（引起血尿和蛋白尿）和微血栓形成，从而加速肾脏疾病进展。研究人员对gECs进行了重聚类，鉴定了18个亚簇，其中包括9个具有独特转录谱的不同亚群。值得注意的是，gECs的异质性并非主要由特定疾病背景驱动。然而，簇9是个例外，主要来源于多个疾病组。研究人员将簇9注释为gEC_Injury，确定其为潜在的共同损伤特异性亚群。gEC_Injury亚群的特征是高表达Apln、Mir147、Pgf、Actn1、Ercc和Procr。定义该簇的关键转录因子包括Fosl、Tead4和Relb，它们是细胞增殖、迁移、免疫反应和组织修复的已知调节因子。与此分子特征一致，GO分析表明gEC_Injury在功能上富集于与细胞迁移、细胞骨架调节、免疫反应以及血管生成和血管发育相关的过程。
3.6 多种疾病模型诱导肾小球内皮细胞亚群的广泛改变
转录组学分析显示，在肾炎和ADR条件下，gEC_1、gEC_2、gEC_3、gEC_4和gEC_6中存在显著的差异基因表达，且主要表现为转录上调。其中，gEC_1和gEC_2的变化最为明显。观察到这两个亚群的疾病特异性反应：gEC_1在5天肾炎模型中显著上调Spp1、Sparc和Mgp，而gEC_2的特征是在ADR模型中Lrg1、S100a8、Fabp4、Serpine2和Ch25h的表达升高。伪时序轨迹分析进一步描绘了损伤相关状态。状态9主要由来自疾病组的细胞组成，是gEC_Injury亚群的主要分布区。状态10也主要由疾病来源的细胞组成，其中ADR模型是主要贡献者。功能表征显示，状态9在胶原合成与代谢、炎症反应、血管生成以及对细菌来源分子的反应等生物过程方面显著富集。相比之下，状态10主要与细胞对白细胞介素-17和趋化因子的反应、趋化因子介导的信号通路、无机化合物解毒以及对金属离子和无机物质的反应相关。此外，涉及细胞应激、免疫反应、增殖和分化的关键基因——包括Socs3、Nfkbia、Atf3和Icam1——在状态9和状态10中均高表达。
3.7 损伤相关细胞亚群中特定的配体-受体相互作用
研究人员分析了疾病条件下肾小球细胞亚群与其他细胞类型之间的相互作用，发现系膜细胞与其他细胞亚群表现出特别突出的配体-受体关系。值得注意的是，观察到VISFATIN介导的配体-受体相互作用主要存在于Mes_injury和Pod_injury_1亚群之间。这表明来自系膜细胞的细胞外NAMPT可能直接或间接结合并激活足细胞上的Toll样受体4（TLR4）。已知升高的Visfatin可通过TLR4/NF-κB通路促进慢性炎症。与之前的研究一致，先前报道显示系膜细胞在损伤后可能上调Cxcl1的表达。此外，在其他损伤的足细胞亚群中也检测到高表达的Cxcl1。这可能代表了系膜细胞和足细胞共同促进CXCR2高表达的中性粒细胞在肾小球疾病中浸润的一种共享机制。损伤的足细胞也可能通过CADM、CXCL和MIF途径招募巨噬细胞和中性粒细胞。在肾小球细胞类型中，Mif在损伤条件下主要在Pod_injury_1中上调，而其受体——Cd74、Cd44和Cxcr4——在巨噬细胞、中性粒细胞和Pod_Und亚群中高表达。现有证据支持MIF信号在炎症募集中的关键作用。最近的研究表明，MIF-CD44相互作用可能有助于壁层上皮细胞损伤和局灶节段性肾小球硬化的发展。研究结果表明，这可能代表了多种疾病背景下足细胞损伤后肾小球炎症募集的广泛机制。
4 讨论
随着越来越多的肾脏疾病被发现具有遗传因素，以及FSGS、IgAN和DN等疾病易感基因的逐渐确定，探索肾脏疾病的分子机制引起了强烈兴趣。在分子水平上深入分析不同病理和生理条件下肾小球细胞的转录谱特征，有望彻底改变传统的诊断策略，并为肾脏疾病的治疗开辟新途径。因此，研究人员使用单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 来表征肾小球细胞，并进一步识别病理条件下的特征性细胞状态变化。整合基因组学的见解发现，不同肾小球疾病的易感基因富集于不同的细胞类型。具体而言，FSGS相关基因主要在足细胞和系膜细胞中高表达，而DN相关基因则缺乏这种细胞类型特异性富集。这些发现表明，不同肾小球疾病的主要靶点——或最初受损的细胞类型——可能存在显著差异。
迄今为止，对肾小球基因表达的研究几乎都是在细胞群体水平而非单细胞水平进行的。因此，尚不清楚肾小球细胞内是否存在细胞异质性。为了解决这个基本问题，研究人员对11,637个足细胞、21,174个肾小球内皮细胞和36,759个系膜细胞进行了重聚类分析，系统描绘了疾病条件下肾小球细胞亚群的分子改变。值得注意的是，研究发现了不同病理背景下共享的和疾病特异性的分子特征。在足细胞内，出现了一个共享的损伤亚群，其特征是与肌动蛋白细胞骨架组织相关，并高表达Tagln、Cxcl1、Crct1、Angptl7、Tgfb2和Flna。由Tagln编码的Transgelin是一种肌动蛋白结合蛋白，调节肌动蛋白聚合、成束或交联。先前的研究表明，天冬酰胺内肽酶、环孢素A和Smad3抑制剂SIS3可以通过抑制或切割Transgelin来保护足细胞并减少蛋白尿。此外，LPS和血清白蛋白 (SA) 显著上调足细胞中CXCL1的表达。相比之下，也观察到了疾病特异性的足细胞亚群：一个ADR诱导的簇高表达Selenbp1、Lpar1、S100a8、S100a9和Sult1a1，以及一个特异性富集Endou、Cd200、Lgmn、Il18、Dmpk和Spon2的ob/ob特异性簇。足细胞是终末分化的上皮细胞。S100a8通常与S100a9形成异二聚体，称为钙卫蛋白。为了给解释这些发现提供坚实的细胞背景，研究人员将验证重点放在WT1阳性的足细胞上，因为它具有特异性和保守性。S100a8在WT1阳性细胞中的共表达直接证明了这些足细胞本身处于激活或损伤状态。S100a8/S100a9异二聚体可以释放到细胞外空间，与TLR4和RAGE等受体结合，激活邻近的足细胞、肾小管上皮细胞和浸润的免疫细胞。这些亚群之间的转录因子（TF）活性也存在显著差异。例如，损伤的足细胞表现出Bcl3、Rela、Fosl1和Nfkb2等TF的激活，为了解足细胞损伤期间的上游调控事件提供了更深入的见解。AP-1通路似乎在足细胞中发挥着双重且依赖于背景的作用：它在成熟过程中下调（如在12周龄与3周龄小鼠中所见），并可能在低稳态水平上支持分化状态，但其在疾病相关的POD-AP1亚群中的持续高水平激活与去分化和损伤密切相关。
在糖尿病条件下，系膜细胞经历了独特的转录重编程，并产生了一个独特的亚群，其特征是高表达Aldh1a2、Thbs1、Fbln5、Cdh11和Loxl2。ALDH1A2是视黄酸 (RA) 合成中的限速酶，对肾脏发育至关重要，并催化视黄醇氧化为RA。RA代谢失调被认为是糖尿病肾病 (DN) 的一个关键致病因素。由DBP编码的D位点结合蛋白（DBP）调节视黄醇代谢和TGF-β1信号传导。数据显示，在DN的该特定系膜细胞亚群中DBP高度激活，表明DBP可能驱动视黄醇代谢失调，这反映在升高的Aldh1a2表达上。由Thbs1编码的THBS1与多种细胞外基质 (ECM) 成分相互作用——包括胶原蛋白V和VII、纤维蛋白原、jagged1、层粘连蛋白、MMP-2、MMP-9、TGF-β、CD36和血管性血友病因子——所有这些都与系膜ECM稳态密切相关。研究发现Thbs1是DN系膜细胞中的一个枢纽基因。此外，Fbln5、CDH11和Loxl2都与ECM调节和纤维化过程有密切联系。研究还观察到转录因子Prrx2在DN系膜细胞中的激活，这可能进一步加强TGF-β介导的纤维化信号传导。总之，这些发现表明DN中的系膜细胞获得了一种明显的促纤维化、基质分泌表型。此外，与之前的报告一致，研究证实损伤的系膜细胞高表达Cxcl1。伪时序分析进一步揭示，来自ob/ob小鼠的系膜细胞富含抗原呈递相关功能。这些结果意味着在疾病状态下，系膜细胞可能具有免疫调节特性，并与免疫细胞进行主动的相互作用。
与足细胞和系膜细胞相反，分析并未揭示不同病理模型中疾病特异性的肾小球内皮细胞 (gEC) 亚群。相反，gECs表现出共同的损伤反应，其特征是一个共享的亚群，高表达Apln、Mir147、Pgf、Actn1、Ercc1和Procr。由Apln编码的Apelin是一种内源性分泌肽，与孤儿受体APJ (APLNR) 结合，参与血管舒张、血压调节、心脏收缩力和能量代谢。ACTN1是一种肌动蛋白交联蛋白，是细胞中细胞骨架和收缩装置的关键组成部分。内皮细胞中肌动蛋白丝相关基因的上调通常代表对机械、化学或炎症刺激的适应性反应。这种反应可能起到保护作用——例如加强屏障功能或促进血管生成——但也可能先于或驱动病理过程，包括内皮-间质转化和血管硬化。
研究存在几个局限性。首先，分析仅限于四种不同的疾病模型和健康对照，未包括ANCA相关肾小球肾炎等继发性肾小球疾病。纳入更广泛的疾病模型（如膜性肾病）和不同的疾病阶段将加强结论的普适性。其次，研究仅关注了三种主要的肾小球细胞类型——足细胞、系膜细胞和内皮细胞，未探索其他相关群体，如已知与肾小球细胞密切相互作用的免疫细胞。第三，研究缺乏对已识别关键候选基因的实验性功能验证。需要获得性或功能丧失实验的直接证据来确认它们在疾病发病机制中的因果关系，这仍然是未来研究的重要目标。最后，纳入更多患者来源的样本对于更全面地评估小鼠模型与人类疾病之间的一致性和转化相关性至关重要。总而言之，该研究生成了一个全面且标准化的小鼠肾小球单细胞RNA测序图谱。研究证明了细胞组成变化在驱动广泛表达差异中的关键作用，观察到了细胞类型特异性基因表达的变化，并识别了疾病条件下的损伤模式。这些发现为理解肾脏疾病提供了重要见解，并为未来旨在理解和治疗肾脏疾病的研究奠定了基础。
5 结论
肾小球疾病的致病机制——在不同类型肾小球疾病中共有的和独特的——仍未得到充分理解。通过系统比较四种不同的疾病模型和健康对照，研究揭示了主要细胞类型中的两种不同反应模式和一种共同反应，并阐明了糖尿病肾病中一种新型疾病特异性细胞亚群的致病作用。
