《Plant Biotechnology Journal》：Methionine Synthase Positively Regulates Plant Defence to Both RNA and DNA Viruses and Is Useful for Developing Broad-Spectrum Antiviral Resistance in Crops
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本文推荐一篇关于植物广谱抗病毒机制的重要原创研究。研究发现，蛋氨酸合酶（MS）通过与多种植物病毒的基因沉默抑制子（VSR）互作，干扰其功能，从而在单子叶和双子叶作物中均能正向调控对多种RNA和DNA病毒的抗性，这为通过基因工程培育广谱抗病毒作物提供了一个极具前景的新靶点。
蛋氨酸合酶正向调控植物对多种RNA和DNA病毒的防御能力，为作物广谱抗病育种提供新靶点
植物病毒是全球农作物生产中的重大威胁，每年造成巨大经济损失。开发广谱抗性品种是控制病毒病害最有效的方法。本研究首次揭示了植物蛋氨酸合酶（Methionine Synthase， MS）作为宿主抗病毒防御的正向调控因子，通过干扰病毒编码的基因沉默抑制子（VSR）的功能，在多种重要作物中赋予了对多种RNA和DNA病毒的广谱抗性。
引言
植物病毒种类繁多，危害严重，利用抗性品种是最经济环保的防治手段。然而，作物常受到多种病毒及其不同毒株的侵染，发掘具有广谱抗性的基因至关重要。目前已知的广谱抗病毒基因数量有限，主要集中在针对单一病毒的多个毒株或少数几种病毒。宿主抗病毒RNA干扰是植物防御的核心机制，而病毒则通过编码VSR来抑制这一通路。植物也进化出多种方式反制VSR，例如通过固有免疫受体识别VSR触发效应子触发的免疫、通过泛素-蛋白酶体或自噬途径降解VSR、对VSR进行翻译后修饰，或产生直接结合并失活VSR的特定抑制蛋白。这些VSR抑制剂具有重要的科学和应用价值，是发掘广谱抗病基因的宝库。
大麦黄矮病毒是危害全球禾谷类作物的重要病原。其17K蛋白是一个多功能的VSR，同时具备运动蛋白和抑制宿主有丝分裂的功能。通过研究17K与宿主的相互作用，有助于发掘增强宿主抗性的基因和过程。
结果
BYDV的17K VSR与拟南芥、大麦和小麦的MS蛋白互作
为了鉴定BYDV 17K的潜在互作蛋白，研究团队在转基因拟南芥株系中进行免疫沉淀偶联质谱分析，鉴定出5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶1，即蛋氨酸合酶1。酵母双杂交、分裂荧光素酶互补和免疫共沉淀实验均证实了17K与AtMS1的互作。进一步发现，大麦的HvMS1和HvMS2、普通小麦的六个MS同源蛋白均能与17K互作。免疫共沉淀实验进一步证实，在BYDV感染的大麦和小麦植株中，MS抗体能够沉淀出17K蛋白，而模拟接种的对照组中则没有，说明这种互作在病毒感染的植物体内确实发生。
降低MS基因表达会损害大麦和小麦对BYDV感染的防御
在BYDV感染过程中，大麦和小麦中MS基因的转录水平和蛋白丰度在早期上调。利用大麦条纹花叶病毒介导的基因沉默技术降低大麦HvMS表达后，植株对BYDV表现出更高的感病性，病毒CP基因表达和17K蛋白积累水平显著升高。在小麦中，利用CRISPR/Cas9技术创制了TaMS1和TaMS2多个同源基因的敲除或功能破坏型突变体。与野生型对照相比，这些MS蛋白丰度降低的突变体在感染BYDV后，病毒17K的转录本和蛋白积累量更高，根系生长受到更严重的抑制，在灌浆期表现出更严重的黄矮病症状。其中，敲除表达量较高的TaMS1A或同时敲除TaMS1A和TaMS2A，会使植株对BYDV更为敏感。
过表达HvMS1增强小麦对BYDV和BSMV的抗性
研究构建了过表达FLAG标记的HvMS1蛋白的小麦转基因株系。在正常生长条件下，这些过表达株系植株稍矮，但籽粒大小、单粒重和单株产量有所提高。在BYDV感染试验中，过表达株系表现出更强的抗性：植株高度和根长显著优于对照，病毒RNA积累显著减少，BYDV 17K转录本和蛋白水平大幅降低。此外，过表达株系对另一种小麦病毒——大麦条纹花叶病毒也表现出更强的抗性，叶片病状更轻，病毒CP基因的转录和蛋白水平也更低。这些数据表明，过表达HvMS1能提升小麦对BYDV和BSMV的抗性。
NbMS正向调控宿主对多种RNA和DNA病毒的防御
为了验证MS蛋白是否对多种病毒具有广谱抗性，研究在本氏烟中进行验证。利用TRV介导的基因编辑技术，创制了针对四个NbMS基因成员的双突变体（nbms ac和nbms ad）。这些突变体NbMS蛋白水平降低了28%-46%。当感染马铃薯X病毒、烟草脆裂病毒或甜菜严重曲顶病毒时，与对照相比，突变体表现出更严重的病症、更强的病毒基因积累和更快的病程发展。反之，过表达HA标记的HvMS1的本氏烟转基因株系，则对PVX、TRV和BSCTV的感染表现出更强的抗性：症状更轻，病毒积累量更低。这些结果表明，NbMS基因是宿主防御多种植物RNA和DNA病毒的正向调控因子。
植物MS蛋白能与多种RNA和DNA病毒的VSR互作并抑制其抗基因沉默功能
为了探究MS蛋白正向调控抗病毒防御的机制，研究检测了HvMS1是否能结合不同病毒的VSR并抑制其功能。实验证实，HvMS1能与BSMV的γb、PVX的25K、TRV的16K、BSCTV的C2以及TBSV的P19等VSR蛋白互作。更重要的是，在16c烟草（一个具有组成型基因沉默活性的系统）中进行的抗沉默功能实验表明，虽然这些VSR本身能够恢复GFP的表达（证明其具有抑制基因沉默的活性），但共表达HvMS1会显著削弱这种能力，表现为GFP荧光、转录本和蛋白积累水平的下降。而对照GUS蛋白的表达则没有这种抑制效果。此外，研究还发现HvMS1能与另外四种病毒的VSR互作，并同样抑制其抗沉默功能。这些数据表明，植物MS蛋白能够广泛地与多种RNA和DNA病毒的VSR相互作用，并抑制其抗基因沉默功能。
讨论
本研究首次提供了植物MS蛋白正向调控抗病毒防御的直接遗传和分子证据。研究数据表明，MS蛋白通过结合并抑制多种病毒VSR的抗沉默功能，从而在单子叶和双子叶植物中增强对RNA和DNA病毒的广谱抗性。这与病毒侵染后MS基因表达上调的现象一致，推测这是宿主增强防御的一种反应。本研究发现的MS蛋白，与先前报道的rgs-CaM、ZmVDE和ZmTGL等VSR抑制剂类似，代表了一类新的、通过直接互作抑制VSR功能的宿主抗病毒蛋白。初步分析表明，HvMS1与VSR的互作可能涉及蛋白界面静电互补性，这有助于解释其为何能与序列同源性低的多种VSR结合。此外，有研究提示蛋氨酸循环相关代谢物如S-腺苷甲硫氨酸的增加可能通过稳定病毒来源的小干扰RNA或影响乙烯合成来增强抗性，这为MS蛋白的抗病毒机制提供了更多探索方向。
鉴于气候变化加剧了植物病毒病的发生，培育具有广谱抗性的作物品种至关重要。本研究结果表明，植物MS蛋白是一个可用于设计作物广谱抗病毒性的有价值靶标。值得注意的是，过表达HvMS1的小麦品系还表现出改良的农艺性状，这预示着MS蛋白的工程化改造可能带来抗病与增产的双重效益。未来，利用人工智能辅助的蛋白质/mRNA修饰和创新的基因组编辑技术，对植物MS蛋白进行研究和改造，有望推动开发出对包括RNA和DNA病毒在内的多种病原体具有优异广谱抗性的作物品种。
材料与方法
本研究使用了多种植物材料，包括大麦品种Golden Promise、拟南芥Col-0、小麦品种Fielder和本氏烟。病毒接种、基因克隆、载体构建、抗体制备等均按标准流程进行。蛋白质互作鉴定采用了免疫沉淀偶联质谱、酵母双杂交、分裂荧光素酶互补、双分子荧光互补和免疫共沉淀等多种技术。基因功能研究手段包括病毒诱导的基因沉默、CRISPR/Cas9介导的基因编辑以及农杆菌介导的转基因过表达。病毒积累和基因表达分析采用了RNA印迹、DNA印迹、RT-qPCR和蛋白免疫印迹等方法。生物信息学分析用于鉴定不同物种中的MS同源基因，并利用AlphaFold 3进行蛋白质结构建模和静电势分析。
