水稻羟基肉桂酰转移酶OsSHT1/2活性自然变异通过调控苯丙烷代谢赋予抗菌性

《Plant Biotechnology Journal》：Natural Variations in the Activity of Hydroxycinnamoyl Transferases Promote Accumulation of Metabolites Conferring Rice Resistance

这项研究通过解析水稻羟基肉桂酰转移酶OsSHT1与OsSHT2的功能，揭示了它们通过调控苯丙烷代谢途径，影响抗菌中间代谢物（如p-香豆酸、阿魏酸）和最终代谢物（如木质素、黄酮）的积累，从而决定水稻对细菌性病原菌（Xoo、Xoc）抗性的新机制。研究发现转录因子OsMYB30能直接抑制OsSHT1/2的表达，其天然变异体OsMYB30D239因蛋白稳定性更强而抑制能力更佳。通过鉴定OsSHT1/2及OsMYB30的优势单倍型（Hap1/D239），该研究为水稻抗病育种提供了宝贵的遗传资源和分子模块（OsMYB30-OsSHTs）。

　　

1 引言

植物在应对病原菌攻击时会启动复杂的防御策略，其中苯丙烷代谢途径产生的次生代谢物扮演着关键角色。木质素和黄酮类化合物是两类重要的最终代谢物，而p-香豆酸和阿魏酸等中间代谢物则被报道对侵染人类和动物的病原菌具有毒性作用，但其在植物病原菌中的作用尚不清楚。先前的研究预测水稻中的OsSHT1和OsSHT2编码羟基肉桂酰转移酶，但其具体的酶学功能及其在植物免疫中的作用机制仍是未知领域。

2.1 病原菌侵染诱导OsSHT1和OsSHT2表达

研究表明，OsSHT1和OsSHT2在水稻不同组织中均有表达，其中在叶鞘和茎中表达相对最高，根部最低。当水稻叶片受到白叶枯病菌（Xanthomonas oryzaepv. oryzae, Xoo）和细菌性条斑病菌（X. oryzaepv. oryzicola, Xoc）侵染时，这两个基因的表达均被显著诱导，暗示它们可能参与水稻的免疫反应。

2.2 OsSHT1和OsSHT2负调控水稻对细菌性病原菌的抗性

为探究OsSHT1和OsSHT2在抗病中的作用，研究团队利用CRISPR/Cas9技术在ZH11背景中创建了ossht1和ossht2的单突变体及双突变体。接种实验表明，与野生型相比，ossht1和ossht2单突变体对多种Xoo和Xoc菌株均表现出更强的抗性，病斑长度更短，叶片内病原菌数量显著降低。双突变体ossht1/2的抗性进一步增强。此外，突变体中病程相关基因（OsPR1, OsPR10）和抗病反应基因（OsWRKY45）的表达也显著上调。这些结果共同表明OsSHT1和OsSHT2以功能叠加的方式负调控水稻对细菌病原菌的抗性。

2.3 OsSHT1和OsSHT2是具有功能的羟基肉桂酰转移酶

亚细胞定位实验证实OsSHT1和OsSHT2定位于细胞质。蛋白序列比对和系统发育分析显示它们与其他植物的SHT蛋白高度同源，具有保守的HXXXD和DXGWX结构域。体外酶活分析显示，重组OsSHT1和OsSHT2蛋白能利用p-香豆酰辅酶A（p-Coumaroyl-CoA）和阿魏酰辅酶A（feruloyl-CoA）作为酰基供体，并以亚精胺（spermidine）为最偏好受体，其次为精胺（spermine）和腐胺（putrescine）。酶动力学参数表明OsSHT2的催化效率高于OsSHT1。

2.4 敲除OsSHT1和OsSHT2改变代谢物积累

体内验证发现，ossht1和ossht2突变体叶片中，以亚精胺为受体的羟基肉桂酰转移酶活性显著降低，其直接催化产物香豆酰亚精胺（coumaroyl spermidine）和阿魏酰亚精胺（feruloyl spermidine）的含量也相应减少。与此同时，作为催化底物的p-香豆酸（p-Coumaric acid）和阿魏酸（ferulic acid）则显著积累。双突变体中的这些变化更为显著。

2.5 p-香豆酸和阿魏酸抑制细菌病原菌的生长

鉴于突变体中积累的p-香豆酸和阿魏酸具有已知的抗菌潜力，研究测试了这两种化合物对Xoo和Xoc毒力因子的影响。实验表明，p-香豆酸和阿魏酸能剂量依赖性地抑制这两种病原菌的鞭毛运动性和胞外多糖（EPS）的产生。它们的半抑制浓度（IC₅₀）在1.22至1.87 mM之间。在接种病原菌前向菌液中添加这两种化合物，能显著减轻水稻的发病程度，证实了它们直接的抗菌作用。

2.6 敲除OsSHT1和OsSHT2改变木质素和黄酮的积累

p-香豆酰辅酶A和阿魏酰辅酶A也是苯丙烷途径中合成木质素和黄酮类物质的关键前体。研究发现，ossht1和ossht2突变体中，多个木质素合成相关基因（如OsCCR20, OsCAD2）和黄酮合成相关基因（如OsCHS1, OsCHI）的表达显著上调。组织化学染色和定量分析证实，突变体叶片维管束中木质素沉积增加，总木质素和黄酮含量也显著高于野生型。这表明敲除OsSHT1/2阻断了向香豆酰亚精胺和阿魏酰亚精胺的分支代谢，使得代谢流更多地导向木质素和黄酮的合成。

2.7 敲除OsSHT1和OsSHT2不影响水杨酸积累和农艺性状

苯丙烷途径也参与水杨酸（SA）的生物合成。然而，测量发现ossht1和ossht2突变体中的SA水平与野生型无异，说明该基因的缺失并不影响SA途径。此外，突变体在株高、旗叶长、穗数、粒型、千粒重等一系列重要农艺性状上与野生型没有显著差异，表明敲除这两个基因在增强抗性的同时不会对水稻生长和产量造成不利影响。

2.8 OsSHT1和OsSHT2的自然变异

通过对RiceVarMap数据库中超过4500份水稻种质的序列分析，在OsSHT1和OsSHT2的启动子区分别鉴定出11和12个单核苷酸多态性（SNPs），并据此划分为两种单倍型（Hap1和Hap2）。其中，OsSHT1^Hap1和OsSHT2^Hap1主要分布在热带粳稻和温带粳稻中，而OsSHT1^Hap2和OsSHT2^Hap2则主要分布在籼稻、中间型和Aus稻中。对100份微型核心种质的抗性评价显示，携带Hap1单倍型的材料病斑更短，且OsSHT1/2的表达水平显著低于携带Hap2的材料，这与基因的负调控抗性功能一致。对野生稻（Oryza rufipogon）和杂交稻的分析发现，优势单倍型组合（OsSHT1^Hap1+ OsSHT2^Hap1）在野生稻中广泛分布，但在现代杂交稻育种中尚未被广泛聚合利用。

2.9 OsSHT1或OsSHT2的变异改变苯丙烷代谢

对不同单倍型组合水稻材料的代谢分析进一步证实了这一机制。携带OsSHT1^Hap1和OsSHT2^Hap1的材料，其羟基肉桂酰转移酶活性最低，香豆酰亚精胺和阿魏酰亚精胺含量最少，而p-香豆酸、阿魏酸、木质素和黄酮的含量则最高。相反，携带OsSHT1^Hap2和OsSHT2^Hap2的材料则呈现相反的趋势。这证明OsSHT1/2的自然变异通过影响其表达水平，进而精准调控苯丙烷代谢物的流向和积累，最终决定抗病表型。

2.10 OsMYB30抑制OsSHTs的转录

为寻找上游调控因子，研究通过酵母单杂交筛选发现转录因子OsMYB30能结合到OsSHT1和OsSHT2的启动子上。序列分析发现这两个启动子均含有OsMYB30的结合基序MC1。实验证实，在OsMYB30过表达（OsMYB30ox）株系中，OsSHT1/2的表达被抑制；而在OsMYB30敲除（OsMYB30KO）株系中，其表达则上升。电泳迁移率变动分析（EMSA）、染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）以及水稻原生质体瞬时表达实验均证实，OsMYB30能直接结合到OsSHT1/2启动子的MC1序列上，并抑制其转录活性。

2.11 OsMYB30在遗传上作用于OsSHTs上游

遗传学实验进一步验证了OsMYB30与OsSHTs的上下级关系。osmyb30单突变体对Xoo表现为感病性增强，而osmyb30 ossht1/2三突变体则恢复了与ossht1/2双突变体相似的抗性表型，表明OsSHTs位于OsMYB30的下游执行功能。代谢物测量显示，OsMYB30ox植株中香豆酰亚精胺和阿魏酰亚精胺含量降低，而p-香豆酸、阿魏酸、木质素和黄酮含量升高；OsMYB30KO植株则呈现相反变化。这证明了OsMYB30通过抑制OsSHTs的表达来调控苯丙烷代谢流向。

2.12 OsMYB30和OsSHTs的自然变异共同决定抗性

对超过4000份水稻种质的分析发现，OsMYB30编码区存在一个SNP（838G/A），导致第239位氨基酸由天冬氨酸（D）变为谷氨酸（E），形成了OsMYB30^D239和OsMYB30^E239两种单倍型。携带OsMYB30^D239的材料对Xoo的抗性更强。虽然两种蛋白的亚细胞定位和与DNA的结合亲和力无差异，但细胞游离降解实验和双荧光素酶报告实验表明，OsMYB30^D239蛋白比OsMYB30^E239更稳定，因此对OsSHT1/2转录的抑制能力更强。在自然种质中，OsMYB30^D239单倍型也与更低的OsSHT1/2表达水平和更强的抗性相关。

3 讨论

本研究系统阐明了OsSHT1和OsSHT2作为羟基肉桂酰转移酶，催化苯丙烷代谢的一个分支（生成香豆酰亚精胺和阿魏酰亚精胺），从而与合成木质素和黄酮的主流途径形成竞争。当这两个基因的功能缺失或表达被抑制时，代谢流转向，导致具有直接抗菌活性的中间代谢物（p-香豆酸、阿魏酸）和增强物理/化学屏障的最终代谢物（木质素、黄酮）同时积累，协同赋予水稻对Xoo和Xoc的抗性。转录因子OsMYB30作为该通路的关键上游负调控因子，直接抑制OsSHT1/2的表达，从而正向调控抗性。研究发现的天然优势单倍型OsMYB30^D239、OsSHT1^Hap1和OsSHT2^Hap1为通过分子标记辅助选择聚合多个优异等位基因，培育广谱、持久抗病的水稻新品种提供了重要的遗传资源和理论依据。