《Plant Biotechnology Journal》：OsbHLH064, an IVb bHLH Transcription Factor, Regulates Iron Homeostasis and Enhances Grain Fe Accumulation in Rice
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本文推荐一项针对水稻IVb亚组转录因子OsbHLH064的深入研究。作者通过功能缺失与过表达实验，结合转录组（RNA-seq）、蛋白质互作（Y2H、BiFC、Co-IP）和全基因组结合位点分析（DAP-seq），系统揭示了OsbHLH064通过直接结合靶基因启动子（如 OsIRO2、OsIRO3）并与IVc亚组bHLH（如OsPRI1）竞争性互作，在铁充足条件下精细抑制铁吸收、转运及信号通路相关基因的表达，从而维持水稻铁稳态平衡。值得注意的是，OsbHLH064的过表达能显著提高糙米中铁（Fe）、锌（Zn）和锰（Mn）的含量，同时引发铁缺乏条件下的铁超载与活性氧（ROS）爆发。本研究不仅阐明了OsbHLH064作为上游负调控因子的分子机制，更为水稻铁生物强化提供了新策略。
铁（Fe）是植物生长和发育必不可少的微量营养素，其稳态的维持依赖于复杂的调控网络，其中碱性螺旋-环-螺旋（basic Helix-Loop-Helix， bHLH）转录因子发挥着核心作用。然而，这些因子如何协同调控这一关键过程尚未完全阐明。本研究聚焦于水稻中一个先前未被深入研究的IVb亚组bHLH转录因子——OsbHLH064，系统揭示了其在铁稳态中的关键角色及其在提高谷物铁含量方面的潜力。
OsbHLH064与IVc亚组bHLH转录因子互作并定位于细胞核
研究发现，OsbHLH064能够与自身形成同源二聚体，并与IVc亚组的bHLH蛋白（OsPRI1、OsPRI2、OsPRI3和OsPRI4）形成异源二聚体，但不能与其他IVb亚组成员互作。这种相互作用通过酵母双杂交、双分子荧光互补和免疫共沉淀实验得到了证实。亚细胞定位分析显示，OsbHLH064本身同时定位于细胞核和内质网，但与IVc亚组的bHLH蛋白共表达时，其核定位显著增强，这提示IVc蛋白可能通过互作促进OsbHLH064的核积累，进而影响其转录调控功能。
铁有效性调控OsbHLH064在根中的表达
基因表达分析表明，OsbHLH064在水稻多个组织中均有表达。特别值得注意的是，其表达受铁供应状况的调节：在根中，铁过量条件下OsbHLH064表达上调，而铁缺乏条件下其表达被抑制。这一趋势通过启动子-GUS融合转基因株系的组织化学染色和定量GUS酶活测定得到了进一步验证。
OsbHLH064功能缺失改变铁稳态相关基因的基础表达
利用CRISPR/Cas9技术构建的OsbHLH064功能缺失突变体，在表型上未观察到与野生型的显著差异，铁含量也无明显变化。然而，转录组测序（RNA-seq）分析揭示，在铁充足条件下，突变体中大量铁稳态相关基因被组成型上调。这些基因涵盖了铁摄取（如 OsYSL15、OsTOM1）、铁螯合剂烟酰胺（Nicotianamine， NA）和脱氧麦根酸（Deoxymugineic Acid， DMA）的生物合成（如 OsNAS1、OsNAS2、OsNAAT1、OsDMAS1）、铁转运（如 OsNRAMP1、OsYSL2）以及铁信号传导（如 OsIRO2、OsIRO3、OsFIT、OsIMA1、OsOPT7）等多个通路的关键组分。相比之下，在铁缺乏条件下，突变体与野生型之间这些基因的表达水平趋于一致。这表明OsbHLH064的主要功能在于抑制铁充足条件下铁稳态相关基因的“渗漏”表达，防止铁过度积累。
过表达OsbHLH064导致铁缺乏超敏反应、铁超载及ROS爆发
与功能缺失突变体的表型形成鲜明对比，OsbHLH064过表达株系表现出对铁缺乏的极端敏感性，在短期铁缺乏处理后迅速出现叶片萎蔫、褪绿、坏死斑直至植株死亡。生理生化分析显示，过表达株系无论在铁充足还是铁缺乏条件下，其根、老叶和幼叶中的铁含量均显著高于野生型。组织化学染色（Perls’ Prussian blue）也直观地证实了叶片中铁的过量沉积。与此同时，过表达株系在铁缺乏条件下表现出强烈的活性氧（Reactive Oxygen Species， ROS）爆发，包括超氧阴离子（O2?）和过氧化氢（H2O2）的过量积累，这被认为是导致其细胞死亡和坏死表型的主要原因。
OsbHLH064过表达抑制铁稳态相关基因表达并显著提高谷物铁含量
分子机制上，过表达OsbHLH064强烈抑制了铁稳态核心调控因子OsIRO2以及下游铁摄取（Strategy II）相关基因（如 OsNAS1、OsNAS2、OsYSL15、OsTOM1）的表达，即使在铁缺乏条件下，其诱导表达也受到严重阻碍。值得注意的是，尽管营养生长阶段表现出铁缺乏超敏，但OsbHLH064过表达株系在田间（水稻土）条件下能够正常生长至成熟，并且其糙米中的铁（Fe）含量显著提高，锌（Zn）和锰（Mn）含量也有所增加，而铜（Cu）和镉（Cd）含量不变。关键农艺性状，如结实率和单株产量，与野生型无显著差异。这表明通过调控OsbHLH064，可以在不牺牲产量的前提下实现水稻籽粒的铁生物强化，具有重要的应用潜力。
全基因组鉴定OsbHLH064结合靶点及其调控机制
通过DNA亲和纯化测序（DAP-seq），研究人员在全基因组范围内鉴定了OsbHLH064的结合位点，共发现12，622个潜在靶基因。富集分析显示，这些靶基因显著富集于“铁离子结合”、“金属离子跨膜转运”等GO条目。结合基序分析揭示，OsbHLH064偏好结合典型的G-box（CACGTG）和E-box（CANNTG）基序。进一步的实验验证表明，OsbHLH064能够直接结合OsIRO2、OsIRO3、OsYSL2、OsIMA1、OsNRAMP1等多个关键铁稳态基因的启动子区域。
深入机制研究发现，OsbHLH064与正调控因子OsPRI1结合相同的顺式作用元件。竞争性电泳迁移率变动分析（EMSA）和双荧光素酶报告基因检测证实，OsbHLH064能够通过与OsPRI1竞争性结合DNA，以及通过蛋白质间相互作用，有效抑制OsPRI1对下游靶基因（如 OsIRO2、OsIRO3）的转录激活活性。这表明OsbHLH064作为一种转录抑制因子，通过“占据”或“隔离”激活因子，精细调控铁稳态网络，防止在铁充足条件下发生不必要的铁吸收和积累。
总结
本研究首次系统阐明了水稻IVb亚组bHLH转录因子OsbHLH064作为铁稳态上游负调控因子的功能。它在铁充足条件下通过直接结合并抑制OsIRO2、OsIRO3等核心调控基因以及广泛的铁吸收、转运和信号通路基因的表达，防止铁过载和相关的氧化损伤。有趣的是，其过表达虽然导致植株对铁缺乏敏感，却能在正常生长条件下显著提升谷物铁含量，且不影响农艺性状。因此，OsbHLH064不仅是理解水稻铁稳态复杂调控网络的关键一环，也为通过分子育种手段培育高铁营养水稻品种提供了极具前景的新靶点。
