《Journal of Biotechnology》：Engineering an Aldoxime Dehydratase with High Activity and Isomer Tolerance for Biosynthesis of an
O-Protected Primary Cyanohydrin
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本研究通过定向进化工程优化了Bacillus sp. Oxb-1的α-氧鎓乙醛肟脱水酶（OxdB），使其能高效催化混合的(E)-和(Z)-2-(苯氧基)乙醛肟异构体转化为无毒的2-苯氧基乙腈（2-BAN），产率达近定量，并成功放大至1克级工业合成规模。
马库斯·V·莫雷诺（Marcus V. Moreno）| 丹尼尔·J·瓦克林（Daniel J. Wackelin）| 埃里克·G·奥尔蒂斯（Erick G. Ortiz）| 埃德蒙德·Y·刘（Edmond Y. Lau）| 纳撒尼尔·B·祖克曼（Nathaniel B. Zuckerman）| 米米·C·杨（Mimi C. Yung）
劳伦斯利弗莫尔国家实验室（Lawrence Livermore National Laboratory），生物科学与生物技术部门（Biosciences and Biotechnology Division），地址：7000 East Ave., L-452, 利弗莫尔, CA 94550, 美国
摘要
o-保护的伯醇氰氢酸酯（甘醇腈）是许多双功能化化合物的重要构建块，也是已知生物活性分子的前体。然而，它们的合成过程中使用了有毒的氰化物，这给工业合成带来了显著的安全隐患。在这里，我们展示了一种无氰化物的酶促合成方法，该方法利用来自Bacillus sp. Oxb-1的工程化醛肟脱氢酶，从(E)-或Z-α-氧保护的醛肟制备o-苄基保护的伯醇氰氢酸酯。与许多随着活性增强而“专门化”的酶不同，我们通过定向进化改造了OxdB，使其能够高效地脱去(E)-或Z-α-氧醛肟混合物中的两种异构体，从而实现接近定量的产率。利用这种酶，我们进一步展示了一条无氰化物的化学酶促途径，从易于获得的醛开始制备o-保护的伯醇氰氢酸酯：首先将醛与羟胺缩合，然后使用我们改造的酶进行脱水反应。该途径可轻松放大到1克规模，并且具有较高的底物负载能力，证明了其在这些重要构建块工业合成中的实用性。
引言
伯醇氰氢酸酯（甘醇腈）及其o保护的类似物是多种双功能化化合物的重要构建块，包括α-氨基醛、α-羟基酸和β-羟基胺（Torres Domínguez等人，2021年；Veum等人，2002年；Zhang等人，2019年）。它们也是已知生物活性药物的前体（Hecht等人，2015年；Phillips等人，2021年；Wang和Li，2022年）。伯醇氰氢酸酯及其衍生物主要通过使用有毒的氰化物或氰化物等效物（如氢氰酸、氰化钠或三甲基硅基氰化物）来合成（Torres Domínguez等人，2021年）。由于安全问题，这些化合物在工业中的应用受到限制。因此，开发一种更温和、无氰化物的合成方法对于未来的合成工作至关重要（图1A）。羟基腈裂解酶为氰氢酸酯的合成提供了一条可能的酶促途径。然而，迄今为止，它们的底物范围仍然仅限于仲醇氰氢酸酯，并且仍需要氰化物来形成产物（Padhi，2017年）。
可以设想一条两步的无氰化物化学酶促途径来合成伯醇氰氢酸酯衍生物，从α-羟基醛开始：（1）醛与羟胺缩合生成醛肟；（2）然后通过醛肟脱氢酶（Oxd）将醛肟脱水生成腈（Martínková等人，2024年；Moller等人，2024年；Yamaguchi和Asano，2024年）（图1B）。这条途径的关键在于找到一种能够接受适当醛肟的Oxd酶。含有血红素的Oxd酶具有保守的结构折叠和较大的疏水活性位点口袋（Matsui等人，2022年；Nomura等人，2013年；Sawai等人，2009年），已被证明可以在无氰化物、温和的水溶液中将各种烷基和芳基烷基醛肟转化为腈（Betke等人，2018年）。此外，最近的研究集中在通过改造Oxd酶来提高其对较长链（C12-C16）脂肪酸醛肟（Yavuzer等人，2023年）或芳香族肟（如苯甲醛肟和2-呋喃醛肟）的活性（Ceyhan和Gr?ger，2025年；Choi等人，2020年；Feng等人，2024年；Hinzmann等人，2023年；Xiao等人，2023年）。然而，只有两种Oxd（OxdFG变体）被证实能够生成氰氢酸酯，而且仅对香豆醛肟转化为仲醇氰氢酸酯（曼德兰腈）的转化活性较低（Kato和Asano，2005年；Xie等人，2003年）。目前文献中很少探讨Oxd酶生成伯醇氰氢酸酯衍生物的潜力。因此，我们着手开发一种Oxd酶，用于合成稳定的o-苄基保护的伯醇氰氢酸酯2-(benzyloxy)乙腈（2-BAN），其中o苄基保护基团可以防止氰氢酸酯的自发分解（Wuts，2014年）。重要的是，这种分子是药物合成的前体（Hecht等人，2015年；Phillips等人，2021年；Wang和Li，2022年），去除苄基后，2-BAN可生成甘醇腈，这是一种重要的化工原料（Pollak等人，2000年）。
2-BAN可以从(E)-和Z-2-(benzyloxy)乙醛肟（2-BAOx）合成（图1B）。2-BAOx的化学合成会产生(E)/Z异构体混合物，因为通常热力学上不稳定的(Z)异构体由于醛肟上的氢原子与α-氧原子之间的分子内氢键而稳定，形成了一个六元环。然而，天然Oxd酶通常对某种醛肟异构体（E或Z）有偏好（Yamaguchi和Asano，2024年）。这种异构体偏好已被用于合成对映纯的腈（Betke等人，2017年）。然而，这些天然的“专用”酶在合成2-BAN时会产生较低的产率，因为它们只能作用于一种异构体。因此，我们试图改造一种对两种醛肟异构体都具有高活性的“通用”Oxd酶，无论起始材料的(E)/Z比例如何，都能实现定量的2-BAN产率（图1C）。
在这里，我们报道了一条化学酶促途径，用于合成o-保护的氰氢酸酯2-BAN：首先将醛2-(benzyloxy)乙醛（2-BAH）与羟胺缩合，然后使用工程化的Oxd将生成的2-BAOx（(E)/Z混合物）脱水生成2-BAN（图1C）。我们选择从Bacillus sp. OxB-1中改造OxdB，因为该酶据报道对4-苯基丁醛肟具有活性（Kato等人，2000年），这是一种与2-BAOx结构相似的底物。OxdB是一种相对热稳定的单结构域酶（Betke等人，2018年；Kato等人，2000年），并且已有晶体结构可用（Matsui等人，2022年）。已有报道尝试通过改造OxdB来提高其对天然底物Z-苯基乙醛肟（Z-PAOx）的活性（Oike等人，2021年）并扩大其底物范围至脂肪酸醛肟（Yavuzer等人，2023年），证明了其可进化性。在这项工作中，我们通过四轮位点饱和突变改造了OxdB，共针对活性位点和底物通道中的十二个残基进行了改造。通过这种改造，我们在(E)异构体上保持了非常高的活性（野生型酶的活性本来就很高），同时也提高了对(Z)异构体的活性（最初活性较低）。我们改造的OxdB对结构不同的(E)-和Z-BAOx异构体都具有高活性，并且在高底物负载下仍能保持高产率，表明这种酶在工业生产中的潜在应用性。
化学品、菌株、质粒和生长条件
除非另有说明，本研究中使用的所有化学品均从Millipore Sigma购买。2-BAN标准品从Ambeed购买。所有引物均从Integrated DNA Technologies购买，并列在表S1中。In-Fusion master mix、Stellar化学感受态的大肠杆菌细胞以及含有阿拉伯糖诱导groES/EL盒的pGro7伴侣质粒均从Takara Bio购买。化学感受态的大肠杆菌 BL21(DE3)细胞从New England Biolabs购买。
初始野生型OxdB活性显示对(E)-2-BAOx异构体的偏好
我们首先评估了野生型OxdB（OxdB-wt）将2-BAOx转化为2-BAN的初始活性。由于已知OxdB对苯基丁醛肟具有活性，我们预计它对2-BAOx也有一定的活性，因为这两种底物在结构上相似（Kato等人，2000年）。在我们的第一次测试中，我们将表达OxdB-wt的大肠杆菌细胞与10 mM 2-BAOx共培养6小时。仅仅2.5分钟后，我们就观察到了几乎完全的转化。
讨论
酶通常被认为对单一底物具有极高的效率和选择性，这通常被解释为活性位点的“钥匙”能够精确匹配。然而，定向进化的成功表明，酶的这种特性可以被利用——即酶对非天然底物的反应能力可以作为进化新活性的起点。在进化过程中，这些多用途的起始酶往往会经历一个
资助
本工作得到了LLNL实验室定向研究与发展奖项（22-ERD-051给MCY）的支持。LLNL的工作是在美国能源部的合同DE-AC52-07NA27344（LLNL-JRNL-2010922）的指导下进行的。
CRediT作者贡献声明
纳撒尼尔·B·祖克曼（Nathaniel B. Zuckerman）：撰写 – 审稿与编辑、资源准备、方法论、概念构建。埃德蒙德·Y·刘（Edmond Y. Lau）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法论、实验设计、数据分析、概念构建。米米·C·杨（Mimi C. Yung）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、方法论、资金获取、概念构建。马库斯·V·莫雷诺（Marcus V. Moreno）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法论、实验设计、数据分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
我们感谢Derrick Kaseman博士对LLNL核磁共振设施的维护。
