《Journal of Chromatography A》：Kinetic plot method for the optimal column and instrument design for high speed chiral SFC applications
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高效液相色谱分离中动能图方法用于优化参数研究，发现流速上限是限制理论板数的关键因素，分析时间随理论板数增加呈倍数增长。
蒂莫西·雅努阿里乌斯（Timothy Januarius）|肯·布罗克霍文（Ken Broeckhoven）|尼科·弗尔沃特（Nico Vervoort）|格特·德斯梅特（Gert Desmet）
布鲁塞尔自由大学化学工程系，Pleinlaan 2，1050，布鲁塞尔，比利时
摘要
本研究提出了一种动力学图方法，该方法可用于探究影响高通量超临界流体色谱（SFC）分离速度的各种不同参数（柱长和内径、颗粒大小、柱外扩散、流速等）。作为代表性示例，该方法已应用于一组实验数据，这些数据是基于4种先进的SFC柱（内径3毫米，长度分别为5厘米和10厘米，填充了1.6微米和3微米的全孔颗粒）和2种分析物得出的平均结果。高通量筛选通常只需要几百个理论板数，研究发现，可用的流速上限是实现如此低的板数并达到颗粒动力学性能极限的主要障碍。在大多数先进仪器中，流速限制在大约4-5毫升/分钟；而内径为3毫米、填充2微米颗粒的柱子分别需要约15、25或35毫升/分钟的泵送流速，才能分别达到N=5000、2000和1000个理论板的分离效果（假设柱压降Δcox = 300巴）。如果流速限制在4毫升/分钟，分析时间将分别比不受此限制时长2.6倍、4.2倍和5.7倍（对于N=5000、2000和1000的情况）。此外，还发现柱子填充得越紧密，达到动力学性能极限所需的流速就越高。其他仪器改进措施，如将柱压降加倍或大幅减少柱外带宽，也有积极影响，但其效果不如提高最大泵送流速显著。
引言
手性分离在制药工业中占所有色谱分离方法的很大比例。长期以来，手性超临界流体色谱（SFC）主要用于制备目的，但现在也越来越被用作关键的分析技术[1]。无论是制备级还是分析级的SFC，在药物设计中都至关重要：分析级SFC用于评估合成中间体和潜在药物候选物的对映纯度，而制备级SFC则用于获得足够量的纯异构体以进行评估。由于移动相组成的可调性，SFC在过去几十年中在手性分离领域变得越来越受欢迎[2]。通过使用专为SFC设计的手性固定相（CSPs），研究人员可以微调分离条件，以实现最佳的对映体分离效果[3][4][5]。Khater和West开发了一种简单高效的方法，能够在6分钟内定量测定化妆品配方中的泛醇对映体[2]。Horácek等人用不到10分钟的时间实现了20种手性混合物（由阴离子簇碳硼烷和金属碳硼烷组成）的分离，证明了SFC相对于HPLC的明显优势[3]。West及其同事报告了对24种手性磺氧化物的对映选择性分离，发现氯化纤维素固定相表现出高的对映选择性[4]。SFC还常被用作高通量筛选方法，例如Sciascera等人用它筛选了包含抗抑郁药、抗癌药、β-阻滞剂和苯二氮卓类药物在内的129种具有不同理化性质的药物化合物[5]。关于SFC在制药领域的更多细节，可参考最近的综述[6,7]。除了制药工业外，SFC还广泛应用于天然产物[1]、农用化学品[8]、法医学[9]、化妆品[2,10]和大麻素分析[11][12]等领域。
SFC的另一个应用驱动力是其环保特性，因为二氧化碳无毒、不可燃且对环境友好。与传统基于溶剂的色谱技术相比，SFC通常还能降低有机溶剂的消耗[1,13]。
在寻找最佳分离条件时，分析师需要能够在很短的时间内测试多种不同的移动相和固定相组合，因此需要高速SFC分离技术。特别是在高通量筛选过程中，需要进行数百甚至数千次实验和分析，快速的分析时间对于缩短“设计-制备-测试-分析”（DMTA）周期至关重要。
在高速SFC领域，Ismail等人进行了相关研究，他们仅用45秒就分离出了脱落酸的对映体[14]。Armstrong的研究小组能够用不到一分钟的时间分离出多种药物感兴趣的对映体对[15]。同一团队进一步将分离同系氨基酸的速度提高到10秒以内[16]。Berger等人[17]在一个专门设计的低扩散SFC系统中使用了1.6微米的Chiralpak IA-U颗粒，将所有170微米的管路替换为最短的120微米管路，并将标准的10微米、13微升流池替换为3微米、2微升流池。通过这些改进，他们实现了约2.8的柱高度，并实现了小于10秒的华法林分离时间。在后续工作中，Ismail等人[18]通过一系列技术调整（包括低体积连接管路、小体积流池、自制的外部柱 oven、外部低扩散进样系统以及电子温度控制器）改进了仪器，使得柱外方差从约85微升2（在2.0毫升/分钟流速下测量）降低到略高于2微升2。与未经改进的仪器相比，完全改进后的SFC系统对于保留因子为1的化合物效率提高了90%以上，对于保留因子为2.5的化合物效率提高了25%以上。
在本研究中，我们描述了如何使用动力学图框架（见第2节）来研究和说明如何优化流速、管路内径、检测器尺寸、柱长、颗粒大小等参数，以进行SFC分离条件的高通量筛选。虽然传统的van Deemter图可以显示带宽随流体速度的变化情况，但动力学图直接用两个最相关的实际参数（分析时间和分离效率N）来表达色谱性能。动力学图的另一个优点是它们还可以直接考虑实际的仪器和柱子限制（例如，有限的柱长或流速；柱外带宽）[20,21]。使用这种动力学图方法需要回答的关键问题是：如何在最短时间内找到产生所需理论板数的最佳柱长和颗粒大小，以及泵的流速和压力限制以及仪器的柱外扩散如何影响这一过程。
为了建立基于实际柱性能数据的动力学图研究，我们选择了一组典型的手性SFC柱（Chiralpak IA柱）的带宽特性。这些颗粒主要是基于其广泛的选择性和在制备格式中的可用性来选择的，并非特别考虑其效率。在每根柱子上，我们为2种不同的化合物建立了SFC下的柱高度曲线，并进行了初步的RPLC效率测试。随后，我们绘制了一条最佳拟合曲线（涵盖了两种不同柱长和颗粒大小的结果），以获得用于所提出的动力学图方法的代表性平均柱高度曲线。同时，近年来刷型手性固定相在效率方面取得了显著改进。例如，Ismail等人[18,19]证明，亚2微米的全孔刷型固定相（如Whelk-O1）在专用低扩散系统下可以实现约1.8的HETP值和超过300,000板/米的效率。
理论
分离的分辨率（R）取决于柱中的理论板数（N）、选择性（α = k2/k1）以及两种最难分离组分中的保留因子（k1和k2）：R = √(N · (α ? 1) · kagv1 + kagv2)。重新表述方程（1）可以得到一个表达式，用户可以利用该表达式计算在给定分辨率、选择性和保留因子下分离一对组分所需的板数：
Neq = 16Rs2 · (α ? 1) · (1 + kagv1 + kagv2)
这个表达式使用户能够计算出所需板数。
材料与方法
我们在4种不同的Chiralpak IA柱（Daicel Corporation，法国Illkirch生产，颗粒尺寸为3微米）上测量了柱高度数据：IA-3（3 x 100毫米和3 x 50毫米）和IA-U（1.6微米颗粒）：3 x 100毫米和3 x 50毫米。这些柱子在两种不同的仪器上进行了测试：Agilent 1290 Infinity II LC系统（Agilent Technologies Inc.，德国Waldbronn）和Waters Acquity UPC2 SFC系统（Waters Corporation，美国Milford）。为了便于读者理解，这里特别提到了IA-U颗粒的特性。
结果与讨论
图1显示了这4种柱子在LC模式下的渗透性测量结果。与理论预期（参见表示理论渗透率Kv0 = dp2/800的虚线）相比，所有柱子的渗透率都低于预期，因此实际渗透率更高。尤其是10厘米长的IA-3柱，其渗透率几乎是理论值的2.5倍。
结论
受近期关于高速SFC研究的启发[14][15][16][17][18][19]，本研究提出了一种动力学图方法，该方法可用于探究影响高通量SFC分离速度的各种不同参数（柱长和内径、颗粒大小、柱外扩散、流速等）。作为代表性示例，该方法已应用于一组实验数据，这些数据是基于2种分析物、2种颗粒大小和2种柱内径得出的平均结果。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。
