《Cytometry Part A》：Traceable Refractive Index Measurements of Liquids to Standardize Extracellular Vesicle Flow Cytometry
编辑推荐：
这篇综述的核心贡献在于首次对细胞外囊泡（EV）流式分析中常用悬浮液（如DPBS、稀释血浆）的折射率（RI）进行了可溯源高精度测量（不确定度<10-5）。研究通过理论与实验证明，当前校准软件（如Rosetta Calibration）假设的RI值与实测值存在差异，这会导致光学直径判定和EV浓度报告出现显著偏差（差异可达35%），从而阻碍EV作为疾病标志物的多中心研究与临床应用。因此，使用可溯源测量的悬浮液RI进行米氏（Mie）理论校准确立了标准化的关键一步。
细胞外囊泡（EV）作为由细胞释放至体液中的生物颗粒，是潜在的疾病生物标志物。流式细胞术是一种高通量表征单个EV的技术。然而，不同灵敏度的流式细胞仪对同一样本会测得不同的EV浓度，这阻碍了多中心研究和EV的临床应用。造成这种差异的关键原因之一是，流式细胞仪测量的光散射信号是任意单位，需要通过校准将其转换为国际单位制（SI）。米氏理论可将光散射信号与EV的光学直径（以nm为单位）联系起来。但是，米氏理论计算需要输入悬浮液的折射率（RI）等参数，而这一参数此前从未被精确、可溯源地测量过。
针对这一空白，本研究旨在对EV流式细胞术中常用的悬浮液进行可溯源的RI测量。研究人员选择了7种常用悬浮液，包括杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS）、生理盐水、鞘液、含0.5%牛血清白蛋白（BSA）的DPBS、含0.5M海藻糖的DPBS，以及海藻糖与BSA的混合液。此外，还制备了人血浆在DPBS中的100倍、140倍和300倍稀释液。测量使用基于最小偏向角法的改进装置在（20 ± 0.03）°C下进行，覆盖了405、436、480、509、546、579和644 nm这七个常用波长，扩展测量不确定度低于1.4×10-5。为了描述RI随波长的变化（即色散关系），研究者评估了33种常用方程，最终选择了一个经验关系式进行最小二乘拟合，拟合误差小于5×10-5。
测量结果显示，不同悬浮液的RI存在差异。例如，在405 nm波长下，水的RI为1.343266，DPBS为1.344599，生理盐水为1.344931，而鞘液最高，为1.346176。添加海藻糖会显著提高RI。对于稀释血浆，其RI高于纯DPBS，但随着稀释倍数增加（超过100倍），RI逐渐趋近于DPBS的RI值，这一发现提示标准化测量可能需要至少100倍的稀释。
为了探究悬浮液RI对EV测量结果的影响，研究建立了一个理论模型。当前常用的校准软件（如Rosetta Calibration）在计算时假设悬浮液的RI为水或水+0.002（即1.34509）。然而，实测的DPBS RI（405 nm下为1.344599）和100倍稀释血浆的RI都与此假设值不同。这种RI的不匹配会导致从光散射信号推导出的EV光学直径与其物理直径产生偏差。
理论计算表明，对于一个给定的有效散射截面（与测量光强成正比），悬浮液RI的假设错误会导致推导出的光学直径出现误差。例如，Rosetta Calibration假设的DPBS RI高于实测值，因此其推导的光学直径会低估EV的实际物理直径。当应用固定的光学直径门限（如300 nm和600 nm）时，RI假设错误会导致所选EV的实际物理直径出现高达37 nm的差异。
由于EV的粒径分布遵循幂律关系，浓度随直径增大而迅速降低，因此这种尺寸门限的偏移会对报告的EV浓度产生重大影响。理论模拟显示，在50至900 nm范围内，使用错误的悬浮液RI可能导致报告的EV浓度与实际浓度之间存在高达35%的差异，具体数值取决于悬浮介质和粒径。例如，对于在DPBS中100倍稀释的血浆样本，使用Rosetta Calibration假设的RI会导致EV浓度报告出现约9%至35%的偏差。
为了验证理论结果，研究人员测量了尿液样本中的EV，并使用不同的悬浮液RI假设进行校准分析。实验得到的浓度差异趋势与理论模拟基本一致，证实了悬浮液RI的准确性对EV浓度测量具有重要影响。
讨论部分指出，为了实现EV流式细胞术浓度测量的可重复性，必须使用可溯源测量的悬浮液RI进行光散射探测器校准。本研究首次提供了DPBS、盐水、水及稀释血浆在相关波长下的高精度RI数据及色散关系。研究结果强调，当前校准软件中假设的RI值不准确，是导致EV光学直径和浓度测量误差的一个重要来源。这种差异可能因样品制备中使用的化学组分（如BSA、海藻糖）而进一步放大。因此，为确保测量准确性和可比性，悬浮介质的RI必须被低不确定度地测量（<10-4）、在校准软件中正确使用并予以报告。
此外，研究也指出了未来的方向：需要建立关于参考颗粒乃至EV本身（核心RI、壳层RI、壳层厚度）的可溯源RI信息。目前测量纳米颗粒RI的方法缺乏可溯源性，开发计量学流式细胞仪是迈向单纳米颗粒浓度、直径和RI可溯源测量的重要一步。
总之，本研究证明，悬浮液折射率的可溯源测量值与当前使用值之间的差异，会导致应用的光学直径门限和报告的EV浓度出现显著不同。在稀释血浆样本中，仅因悬浮液RI的假设不同，使用Rosetta Calibration软件就可能使报告的EV浓度出现高达35%的差异。因此，应采用可溯源测量的悬浮液RI，通过米氏理论校准光散射信号，以提高EV流式细胞术在光学直径和浓度测量方面的准确性。
